新冠肺炎实验室检测的华西经验

生物安全篇      新型冠状病毒肺炎疫情期间，医院检验科工作人员面对患者各类标本，如何进行生物安全防护？具体的防护级别是什么？       疫情期间，医院检验科需面对病毒核酸检测标本量增加、确诊、疑似和普通患者标本不易区分等问题。首先应做好确诊、疑似和普通患者标本的标识，将确诊和疑似患者标本与普通患者标本明确区分。确诊和疑似患者标本，应有独立的双层密封包装，密闭的专用标本转运箱，明确的标识，专人转运，标本交接有记录。其次，标本转运人员、接收人员、高压灭菌人员应做二级生物安全防护；标本检验检测人员应做到三级生物安全防护。普通患者标本，采用相应的标准生物安全防护，如一级或二级生物安全防护措施。最后，应注意保障三级生物安全防护下工作人员的休息。三级生物安全防护下身体被密闭在防护服中，长时间工作易感觉劳累出汗，甚至头晕乏力，因此不建议工作超过4小时。       感染者和非感染者难以区分时，检验人员收到患者标本后应如何防护？        感染者和非感染者难以区分时，应将所有样本视为具有感染性，在独立的实验室空间进行三级生物安全防护（条件允许时）。然而，在条件不允许的情况下可不设置或只设置相对独立的实验室检测空间。检验人员至少按照二级及二级以上的个人生物安全防护。       在防护用品缺乏时，怎样最大程度地进行个人生物安全防护？        首先，管理人员应千方百计保障生物安全防控物资充足。但在疫情突发，病患激增时，生物防护用品可能出现短缺。根据短缺的情况，应该启动分层的生物安全防护预案。根据检验科不同岗位的风险程度，可分为核心防护（疑似新型冠状病毒肺炎患者2019-nCOV病毒核酸检测岗）、重点防护（呼吸道病毒核酸检测岗、流感病毒抗原检测岗、分子实验室标本接收岗、微生物实验室标本接收岗）、加强防护（标本手工开盖、手工操作的岗位）和标准防护（除上述岗位之外的其他岗位）。核心防护和重点防护都应采用生物安全三级实验室的个人防护。加强防护和标准防护应分别采用二级和一级生物安全防护。但当防护等级不能被满足时，优先满足核心防护、其次重点防护。另外，生物安全柜、消毒措施（如有效氯消毒液、75%酒精、紫外线、空气消毒机等）和个人生物安全意识也是非常重要的生物安全要素，在其他安全物资缺乏时需加强。      新型冠状病毒肺炎患者标本病毒核酸提取是否一定需要在负压实验室进行？       按照新型冠状病毒肺炎防治和实验室检测的生物安全相关要求，医学检验工作需要在二级及以上实验室进行，应采用三级生物安全实验室个人防护。因此新型冠状病毒肺炎患者标本病毒核酸提取并没有要求一定要在负压实验室进行（但应在独立空间进行）。对于有条件的检验科，建议使用负压实验室，保障实验室环境和工作人员的生物安全，这是在三级生物防护基础上对生物安全的提升。分析质量篇       样本的采集质量如何保证，以提高检出率？       标本采集可首选肺泡灌洗液或深部咳痰，次选鼻拭子/咽拭子。注意事项：①痰液样本应为清水漱口后，采集深部咳痰；②咽拭子样本应在咽峡深部（悬雍垂及扁桃体两侧）利用植绒拭子反复刮取获得；③鼻拭子样本应在鼻腔深部利用植绒拭子反复刮取获得。常见错误：①利用棉签拭子采样：会影响上皮细胞的洗脱和核酸的提取；②采样后，植绒拭子未置于细胞保存液/生理盐水中保存送检：拭子干燥后会影响核酸的提取；③咽拭子未在正确部位采集：错误的上颚部、口腔中采集，这样不能获取合格的上皮细胞；④未获取深部咳痰，送检唾液痰等。      样本的核酸提取的质量保证及常见错误有哪些？       在样本提取前，应将鼻咽拭子/痰液/肺泡灌洗液样本置于56°C环境中灭活30min，以保证实验室生物安全；灭活后的样本应采取 细胞裂解液+胰蛋白酶 相结合的方式，于37°C环境下裂解消化至少30min，以保证细胞的充分裂解及核酸的释放；应选则离心滤柱法或磁珠法提取样本总核酸，并在相关核酸质量检测通过之后方可用于临床实验检测。常见错误：①在样本采集后，未对样本进行灭活处理，容易造成生物安全风险隐患；②未采用细胞裂解液和胰蛋白酶裂解消化处理，或处理不充分，影响核酸的释放，进而影响核酸的提取效率；③直接裂解+扩增法（一步法）的检测，核酸提取效率低，容易造成漏诊和误诊，不建议采用。     2019-nCoV的PCR检测的结果判读有什么建议？     我们建议，在针对新型冠状病毒（2019-nCoV）检测的时候，所选得基因扩增位点，应首选扩增ORF1ab基因（开放阅读框，保守区域），同时在此基础上同时选择扩增N基因（核壳蛋白）或E基因（小包膜蛋白）中的一种。结果判读模型如下：①当ORF1ab+N或ORF1ab+E组合同时扩增阳性的时候，可判断为 2019-nCoV阳性；IC（内标）：S型扩增；ORF1ab且N基因或E基因 扩增阳性 (Ct值＜35)②当ORF1ab扩增阴性时，无论N或E是否扩增阳性，不能诊断2019-nCoV阳性，应采取复查；IC（内标）：S型扩增；ORF1ab 扩增阴性；N基因/E基因 扩增阳性 （Ct值＜35），需用另一种试剂盒复测；或重新采样复测③当ORF1ab扩增阳性，而N或E扩增阴性时，应认为2019-nCoV高度可疑阳性，可采用第二种试剂进行复查，或进一步采取基因测序以排除可能的病毒突变。IC（内标）：S型扩增；ORF1ab 扩增阳性 （Ct值＜35）；N基因/E基因 扩增阴性，需用另一种试剂盒复测；或用另一种检测方法复测；或测序。    注意事项①核酸的提取质量直接影响PCR检测的质量，因此，必须高度重视核酸的提取和处理；②在实际工作中我们发现，N基因的扩增敏感性高于ORF1ab基因，因此对于N基因扩增阳性但ORF1ab基因扩增阴性的样本，一定要复查检测，或联系临床重新送检；③在同一种方法复查仍不能明确得出结论的样本，应及时更换试剂盒或方法学进行检测。参考文献_Minjin W , Yanbing Z , Zhiyong Z , et al. A precision medicine approach to managing Wuhan Coronavirus pneumonia[J]. Precision Clinical Medicine.
（责任编辑：xsq）