作者 ：陈琦 包美静 王冠群 褚雨晴 林杨单位： 吉林大学第二医院妇产科 130041长春通讯作者：林杨摘 要 产前诊断是降低出生缺陷发生率的重要手段，目前作为金标准的侵入性诊断方法存在导致羊膜腔感染、流产等严重后果的风险。近年来，产前检查的趋势逐步向非侵入性检查转变，无创产前检测（NIPT）可减少非必要的侵入性检查，并对血清学筛查不明确者及侵入性产前诊断禁忌症者等都具有极大意义。本综述旨在阐述NIPT的技术流程以及该技术目前的临床应用和尚存问题。 NIPT的实验室技术及质量控制 1. NIPT的实验室技术：按照一般实验顺序，必要包含以下四个分区：试剂准备区、标本与文库制备区、文库扩增与检测区、测序区；首先在试剂准备区进行所需试剂的储存、配制的前置工作；之后在标本与文库制备区对样本进行血浆分离、DNA提取、末端修复、接头连接与纯化。分离完的血浆样本可在-20 ℃暂存1周，也可在-70℃以下保存3年或以上[4]。后在文库扩增与检测区继续进行PCR扩增与纯化、文库QC、混合文库、混合文库QC；完成上述准备后，在测序区进行测序前准备并上机测序，完成测序得到样本结果进行信息分析，对样本报告审核无误后发放[5]。目前临床上使用无创产前基因检测的一般技术流程如下：抽取孕妇外周静脉血3~5 mL，行血浆胎儿DNA筛查，常规分离血浆、提取外周血DNA片段、制备文库，使用高通量模式上机测序，将获得的原始数据直接传至大型测序仪；通过比对Ensemble数据库中人类基因组参考序列来确定每一个测序的读长（Reads），从而判断胎儿是否存在染色体异常[7, 8]。2. NIPT的质量控制指标：各项质控指标参考国卫办妇幼发〔2016〕45号文件[4]：T21、T18、T13三体综合征检出率分别不得低于95%、85%、70%；致病性拷贝数变异（pathogenicity copy number variation，pCNV）的假阳性率不高于0.5%。总体pCNV的复合阳性预测值不低于30%。 NIPT的临床应用现状 1.NIPT筛查常染色体非整倍体疾病：21三体综合征，即唐氏综合征 (Down syndrome,DS)，是最早被确定也是目前临床最常见的染色体病。相比于18三体综合征(Edwards syndrome,ES）和13三体综合征 (Patau syndrome,PS)，其发病率更高。一篇2017年发表的meta数据分析得出，应用NIPT检测T21、T18、T13的敏感性及特异性均大于99%，远高于血清学筛查70%的准确率[13]，极大程度上避免了侵入性产前检查所导致的流产和胎儿宫内感染等严重后果的风险，具有诊断准确率高、敏感性高、无创伤、低风险的优点。但目前于临床而言，NIPT仍是一种筛查手段，还不能作为最终确诊的方法，由于假阳性结果的存在，在NIPT筛查T21、T18和T13三体高风险情况时，仍需要侵入性诊断加以确诊。2.NIPT筛查胎儿性染色体非整倍体疾病（SCAs）：NIPT技术对性染色体非整倍体疾病（sex chromosome aneuploidies，SCAs）的检测也有较高的准确性[14, 15]。SCAs在新生儿中的发病率近为21三体（发病率约1/800）的2倍。SCAs主要包括先天性卵巢发育不全（又称Turner综合征，45,X）、超雌综合征（47, XXX）、超雄综合征（47, XYY）、克氏综合征（47, XXY）[16]。其中Turner综合征最为常见。魏凤香等[21]研究结果也提示，NIPT可以有效筛检传统血清学筛查漏筛的产前SCA病例。但出现假阳性的可能性较筛查常染色体非整倍体疾病增加，特别是Turner综合征，必须行有创产前诊断确诊。3.NIPT筛查致病性拷贝数变异（pCNV）：拷贝数变异(copy number variations,CNV)是由基因组发生重排而导致的，而该类疾病也在NIPT技术的检测范围之内。国外研究表明，胎儿携带pCNV的比例在孕妇中达1.6%～1.7%[23]。近几年，染色体-微阵列微阵列分析方法(chro-mosome microarray analysis, CMA)现已成为产前诊断细胞遗传学检测中的常规项目[24-26]。童珂雅等[27]研究也提示NIPT是筛查羊水染色体异常的有效手段，并能通过运用CMA技术检测出NIPT结果高风险中严重危害胎儿生长健康的pCNVs。应该明确的是，无创产前检测是一种筛查技术而不是产前诊断。可能存在胎盘和胎儿DNA不一致的情况[28]，而导致假阳性风险，且NIPT筛查pCNV效能不如筛查T21的效能高。 NIPT面临的问题与前景展望 NIPT在应用于临床时所存在的假阳性率也是该技术面临的首要问题。现有研究报道，母体拷贝数变异(mCNV)是NIPT假阳性结果的主要来源[29]。Kaseniit等[30]实验室通过针对mCNV的新算法，使mCNV引起的假阳性率较传统算法减少了600倍。这意味着随着技术发展，即使存在范围广泛的mCNV，NIPT的高特异性也是可能的。另外，NIPT是否可以作为一线筛查技术，还需考虑该筛查技术在不同地区的覆盖度、孕妇接受度以及服务价格等多方面综合因素。虽然NIPT目前并不能取代侵入性穿刺采样检查作为诊断手段，但其为染色体病的精准预防提供了可能性，另有研究表明，NIPT对于单基因疾病（single-gene disorders,SGD）的筛查也具有一定的潜力 [31] 。并且NIPT对血清学筛查不明确者及介入性产前诊断禁忌症者等都具有极大意义，相信未来更好地发挥NIPT的优势，从而尽可能避免使用侵入性采样诊断。 参考文献 [1] 邹朋书, 陈莉莎, 陈霞慧, 等. 产前诊断指征和胎儿染色体异常诊断结果的相关性分析[J]. 中国优生与遗传杂志, 2018,26(07):52-54. 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无创产前检测技术在产前诊断中的临床应用与面临的问题
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