高倍镜扫描与深度学习在检验项目中的应用01 形态学法的血细胞分类计数：上世纪七十年代前，库尔特阻抗法计数细胞还未发明时，血细胞的分类计数都在显微镜下完成。人工形态学分类计数虽然效率低下，重复性差，但它至今依旧是血细胞分类计数的金标准。形态学计数有着阻抗法、激光散射法、荧光染色法无法取代的优势：抗干扰能力强，EDTA抗凝引起的血小板聚集后计数不准的问题，在形态学方法下可以排除；准确性更高，单核细胞与淋巴细胞在瑞氏染色时更容易区分；可计数更多的细胞种类并确认异常细胞；可以检查寄生虫感染，如疟原虫感染。依靠人工显微镜检查的形态学法缺点包括： 效率低下，基本手工操作；主观性强；分类计数的准确性、灵敏度依赖于形态学专家自身的专业能力。使用自动化设备实现基于形态学法（金标准方法）的血细胞分类计数无疑是血细胞仪最终的发展方向。在这个方向上有不少公司进行了尝试并在逐渐实现中。02 Cellavision公司系统介绍：Cellavision是目前使用最广泛的外周血血细胞形态学自动化分类的仪器，位于瑞士的Cellavision公司生产的DM96, DM1200,和DM9600阅片机通常与Sysmex、Beckman Coulter公司的血球流水线联合。触发复检规则的样本进入推片、染色流程后，外周血涂片由阅片机完成100个白细胞的分类计数及相应视野内红细胞的形态学分类。形态学阅片机整合到血球流水线后，血细胞分类计数基本完成了全自动闭环，所有环节都实现了自动化，检验医师只负责对检测结果进行审核。目前五分类血球仪的检测速度平均为100标本/小时，按15%比例复检，每小时约有15张玻片会输送到Cellavision阅片机上。阅片机采集100个白细胞做分类计数，平均每张玻片的分析时间为2分钟，其中中性分叶核粒细胞的分类准确性为92.5%，淋巴细胞为96.4%，单核细胞为81.4%，但对于一些含量低的细胞类型，如幼稚细胞，浆细胞，嗜酸性、嗜碱性粒细胞，检测细胞数量太少易导致漏检或结果不准确，文献同时报道通过增加阅片检测细胞的数量，稀有细胞的检出率灵敏度会提高，综合下来一台阅片机的工作效率接近于一名形态学专家［13］。Cellavision阅片机的工作流程为先使用10x镜扫描样本，找到体尾交界可阅区内的白细胞，然后选择其中的100个白细胞，并使用100x油镜对其依次拍照和分类计数。在实践中，单台阅片机的速度虽然与一个形态学专家相当，但对异常样本的分析能力不足。对于大样本量的机构需要几台设备才能匹配血球仪的速度，更为重要的是，由于机器阅片采样数量少而无法排除假阴性（形态学复片的目的），人工阅片仍不可被取代。03 罗氏公司cobas m 511介绍：罗氏公司在2012年以2.2亿美金收购了Bloodhund公司的一体化图像法血细胞分析仪，并于2017年获得FDA批准用于血细胞分类计数。Bloodhund技术最大的创新点是血细胞喷涂技术，血膜的形成不是传统的推片法，而是由一根细针将血细胞均匀地喷在玻片上。这种方式下制成的血涂片，细胞分布均匀，没有传统推片后的体尾交界处，各类型细胞均匀分布，没有海岸线效应。更为重要的是制片实现了定量血推片，即玻片上的血样体积是固定且样本均匀分布，能够较好地避免采样误差。cobas m 511血细胞计数图像法一体机检测结果与人工镜检总体符合度为95.7%，对异常细胞检测灵敏度与特异性分别是95.9%与74.6%，与Sysmex XN结果相关性R ≥ 0.95。图10显示，通过图像法运算得到各参数结果与血球仪检测结果几乎一致［15］。图10 cobas m 511与Sysmex NX检测结果比较 cobas m 511的各项参数与传统血球仪相当，但其售价在30万美金以上，每小时可检测60个样本，虽然结果可以一步到位，没有再次人工复检的要求，但相对于十分之一售价的五分类血球仪，其性价比明显不足。2018年上市后反响平平，目前已经停止销售。04 Vision Hema (West Medica, Perchtoldsdorf, Austria) 和EasyCell Assistant (Medica Corporation, Bedford, MA, USA) 血细胞形态阅片机与Cellavision原理类似的外周血涂片阅片机目前还有两家公司尚在销售。推出Vision Hema血细胞形态阅片机的West Medica公司位于奥地利，是一家专注于显微成像与分析的公司，该公司拥有完整的基于普通显微镜基础的扫描系统，以及丰富的基于AI算法的分析软件 （包括：外周血涂片血细胞分类计数，骨髓细胞分类计数、微生物分类计数软件、精子形态分析等） 。另一家EasyCell公司的阅片机EasyCell Assistant整体工作流程与Cellavision相同，可以计数100~200个白细胞，准确率相当。此外在过去10年中，国内有多家公司仿制了Cellavision系统，性能与之类似，但目前都已从市场上退出。 05 Bionovation产品设计理念： Cellavision及类似产品 （最高峰时有5家以上） 作为血涂片阅片机尝试替代人工阅片，但实际应用中缺乏实用性，如果不依附血球厂家流水线的打包销售，作为独立产品时，难有生存机会。原因如下： 检测细胞数量过少，稀有细胞计数准确性差，易出现假阴性结果； 速度慢，如果增加采样数量提高灵敏度时，其效率就远低于人工阅片。由于这两点原因，人工阅片无法被完全取代，机器的价值十分有限。对于血涂片，人工阅片的流程为：先低倍镜整体观察全部样本，搜索各种异常可能，如：异常细胞、寄生虫；若发现异常则使用100x油镜观察描述，无异常则选择体尾交界处的100个白细胞作分类计数。基于100个白细胞的报告只对含量超过10%以上的群体可靠，计数含量在1%以下的细胞群体时，细胞计数数量要增加到1000个以上。 流式法的血球仪数据可靠性高的基础是细胞检测数量大，通常白细胞计数超过5000个，这个特性就如同人工全片搜索异常一样，排除了假阴性的存在。在排除假阴性情况下，计数10个、100个或1000个细胞时，只是报告精度不同，不影响样本的定性 （正常或异常） 。 自动化的阅片机只有在满足以下条件时才具有实用价值：检测灵敏度是人工的10倍以上（可以假阳性）； 检测时间是人工的十分之一；综合效率是人工镜检的100倍以上； 机器检测结果由形态学专家复核，假阴性概率低，且形态学专家无需再回到显微镜镜下观察样本。血球仪能成功替代大部分人工镜检也是相同原因： • 计数5000个以上细胞； • 每小时60个样本以上；在复检规则下，几乎无假阴性。如果人工镜检做同样事情时，综合效率会慢百倍以上。通常情况下，血涂片推片的血量在1~2μl左右，正常样本时全片的白细胞数量在4000~20000个。中位值在8000左右，由于形态学检测的特点，单个目标物即可确认，阳性检出率可认为是单个目标物/μl， 这个检测灵敏度是其他方法学无法比拟的 。 为了排除假阴性，血涂片全片扫描是最理想的方式，保证了对样本采样的完整性。 为了识别最小的病原体，光学分辨率必须是0.2μm （NA1.25以上的油镜） ，数字采样分辨率小于0.1μm/像素。单样本的检测时间小于1分钟，即全片数字化时间在60秒内。在这个速度下，阅片机才有可能满足大型医疗机构复片要求 （每天150张血片） ，单例报告半小时内完成。或直接采用形态学法的一步法血细胞计数仪，不再有复片的要求。 图11 Bionovation扫描仪外周血白细胞1024维特征提取后降维到2维后，五分类白细胞的散点图 Bionovation的形态学工作站使用2台IMX250芯片相机时，可在2分钟内完成整张玻片的100x油镜数字化扫描，自动涂片机可使用1~5μl血样制成全单层血片，染色后全片扫描。对于外周血样本，扫描进行时，AI会实时搜索疟原虫感染 （其他寄生虫感染视需要可以执行） 、细菌、分类计数白细胞、血小板及红细胞形态。由于是全片扫描，全片所有细胞都会被分类计数并提示异常，报告时可以指定只计数体尾交界处细胞 （100~100百万个细胞） 。图11为AI计数五分类细胞的2维特征散点图。 由于血涂片全片已完成油镜数字化，形态学专家无需再回到显微镜下观察样本。06 尿沉渣检查的自动化分析： 检验科的三大常规之一：尿沉渣检测，由于其原始样本需要富集，且成份复杂、多样性高，全自动化的历程坎坷，各种方案使用下来都有不足之处。由于尿液样本有形成分浓度不一，金标准方法要求使用浓缩尿提高检测灵敏度过程如下：尿液10 ml离心5 min，相对离心力(RCF)为400，弃上清，留沉渣尿量0.2 ml混匀，吸取20 μl，滴在玻片上用18 mm×18 mm盖片覆盖，先用10×10低倍镜观察全片，再用10×40高倍镜仔细观察，检查细胞至少10个视野，检查管型至少20个低倍视野，报告以高倍视野所见最低至最高数字表示。如果在滴片前使用SM染色或S染色，各有形成份在镜下更易观察。 IRIS及其他图像系统介绍： 同血球仪一样，尿形态学分析仪设计思路也是初筛法，将大部分的阴性样本排除后，人工镜检只检查疑似阳性样本。IRIS于1983年推出全世界第一台自动化尿沉渣检查工作站YellowIris后，开启了尿液自动化分析的历程。下面简单介绍一下Iris iQ200产品 （摘自Beckman Coulter公司Iris iQ200介绍） ［16］ 。图12 Iris iQ200拍摄的尿液有形成分 数字化流式形态学检测： 利用缓冲等张液iQ鞘液的水动力聚集功能及流式细胞计数池的层压进行检测。可实现有形成分以尽量平铺不重叠的方式，最大剖面朝向显微镜镜头进行图像捕捉。自动粒子识别 （APR） 功能对图像中的有形成分进行分隔、特征分析及自动分类。 07 有形成分图像利于屏幕复查和培训 （图12） ： 可直接通过屏幕结果界面进行检测结果的复查，缩短样本周转时间。 有形成分图像可储存，便于样本结果的回顾。•所有检验人员看到的是同一张有形成分图像，利于科室人员培训。Iris尿仪与其他形态学法设备原理类似，原始尿被泵入一定高度空腔流动室内，使用10x、20x物镜 （低NA，高景深） 拍摄尿液。空腔芯片有两种方式：流动型和固定体积型。流动型空腔芯片，尿液在其中连续流动，单次检测尿量可以连续设定，时间越长样本抽样体积越大，灵敏度越高。固定体积型为单次灌注一定体积（100μl~200μl）尿量后，待有形成份沉降到芯片底部拍照。 原始尿液直接形态学检测的最大挑战是如何避免假阴性。 大体积的管型或团块物容易沉底，导致小样本量原始样本取样时容易遗漏。流动中拍照或沉底拍照都存在样本漂浮翻动成像效果不理想的风险。该类型的尿沉渣仪器检测到阳性目标物后，通常需要用户再次按照金标准方法重新制作后镜下复片确认。 08 Sysmex UF流式法尿沉渣仪介绍： 流式细胞仪方法检测液体中的粒子是一个高效工具，Sysmex公司的血球计数技术同样可用于尿液内有型成份的分类计数。使用荧光染色与不同角度散射光，可以区分白细胞、红细胞、管型、结晶与细菌。因为该仪器还是初筛设备，任何阳性样本，都需要用户将尿液离心制片后镜检。 09 Bionovation产品介绍： Bionovation扫描仪使用60X NA1.25油镜，采样分辨率为0.17μm/像素，可全片扫描SM染色后的尿沉渣玻片，扫描时间在60秒内。样本中1μm以下的杆菌、球菌等成分均清晰可见。经SM染色后，尿液标本有形成分原有状态得以保存，且对管型、上皮细胞等成分鉴别有明显优势。通过ResNet50网络训练，可完成自动分类各尿液有形成分。 （图12-图15） 图13 白细胞、上皮细胞及管型 图14 颗粒管型和细胞图像图15 大量白细胞 使用浓缩尿制片观察的最大好处是可以最大可能地排除假阴性，但是连续的大样本量尿常规检测，每个都需要5分钟的离心浓缩后阅片，工作量巨大。Bionovation正在开发更快的样本富集方法，使一个尿常规按标准浓缩法制片后全片扫描、结果输出总时间控制在一分钟以内。 10 胸腹水脱落细胞学检查： 胸腹水样本虽然数量不多，但多涉及有明显症状的传染病或肿瘤诊断。如果送检目的是检查有无结核杆菌或寄生虫感染，通常是临床检验的范畴；但如果送检目的是确认是否存在肿瘤细胞，则是细胞病理的范畴。同一份样本可能会送检至不同部门，但由于样本抽样问题，检验人员看到了肿瘤细胞、病理人员看到了寄生虫或细菌。 如果样本玻片数字化后同时发送两个部门阅片，会在一定程度改善这个情况。 胸腹水及其他体液样本的多样性： 送检胸腹水或其他体液样本时，多是为了查明病因。从感染到肿瘤，引发疾病的原因多样化，所以体液样本阅片时要求形态学专家必须经验丰富，不漏检各种可能性。 体液样本中的细胞浓度不同于血液，前者浓度范围跨度大，如肉眼可见清澈透明的样本中细胞量少，需富集后制片；而血性样本需要稀释后制片。 另外，采集样本的体积差异大，有多到几百毫升的腹水，也有少至几十微升的脑脊液。液基薄层细胞制片技术对于标准化体液样本制作是个理想选择，制片的方法有：①膜过滤法；②离心沉降法；③自然沉降法等。使用标准化的商业仪器制片，可以显著提升制片质量，并且可以定量样本制片，方便计算细胞绝对浓度。缺点是检测成本上升，检验科形态学检查一般收费较低，广泛采用有一定难度。 Bionovation盲扫技术及细胞自发荧光检测： 体液样本中细胞数量过少 （如脑脊液） 是阅片的一个难点，即便只有几个细胞，也无法排除其阳性可能 （有诊断价值） 。镜下搜索往往是形态学专家最花费时间的环节，搜索到异常细胞或有形成份是做出正确诊断的基础，当无法判断属性时，可以求助远程会诊。 样本有形成份过少不仅会使人工阅片时间延长，也会导致大部分显微扫描仪无法工作，因为扫描时需要聚焦样本，当样本中没有物质提供Z轴聚焦高度时，扫描就无法完成。如果使用Bionovation聚焦玻片与算法，可以克服这个问题。 “盲扫”是指仪器扫描玻片时无需聚焦样本，即使载玻片上没有任何物质，仪器依然可以将镜头的焦点锁定在载玻片上方的任意高度， 如扫描玻片上方0.5μm、1μm或5μm层，用来检测不同大小的物质 （图16-图17） 。 图16 Bionovation聚焦玻片图17 无样本聚焦点时，载玻片上固定高度的样本都处于聚焦状态 11 骨髓涂片AI的应用方向： 机器学习最适合于单个目标的识别与分类，在工业生产中被广泛应用，如宏观领域的电路板缺陷检测，微观的晶圆缺陷检测 （工业显微镜） 。机器视觉 （包括深度学习） 在方法、流程上都已经相对成熟，但骨髓细胞分类却鲜有使用自动化机器的。即使Cellavision在外周血、体液检查中应用多年，目前也没有拓展到骨髓细胞分类上。 12 骨髓涂片检查有其特殊性： 制片无法标准化，骨髓穿刺样本多为不抗凝样本，样本采样量小，抽取后直接推片。推片质量差异大，样本厚度高，通常含有骨髓小粒。染色试剂及染色方法实验室已经形成多年习惯并对应一定的阅片习惯，不容易改变或达到室间一致。 细胞分类数量众多，细胞类型为连续过渡，种类之间相互叠加，不满足机器学习分类要求：即类别差异明显要求。 人工阅片时需要全片搜索可能的异常细胞，不像血常规玻片给出100~200个细胞分类计数即可。 玻片数字化时，个人对色彩的感觉不同，不同形态学专家之间对样本细胞颜色设置不统一，AI训练模型大范围内使用有困难。当机器假阴性率比人工高时，机器的作用就有限，这就是当前骨髓形态机器的困境。目前市场上的骨髓细胞阅片机的设计思路同外血周涂片机器类似，在骨髓涂片的任意单层区选取200个细胞报告，但忽略了骨髓阅片时的最关键的步骤：全片搜索并描述可见异常 （99%工作内容） ，而是更关注选取典型区域 （0.9%工作重要性） 、分类计数200个细胞 （机械重复工作） 等相对不重要的内容。 【参考文献】[13]CNN（卷积神经网络）最早是哪一年提出，是如何发展的？- 知乎 (zhihu.com) https://www.zhihu.com/question/47705441.[14]Digital morphology analyzers in hematology: ICSH review and recommendations，nt[J]. J Lab Hematol,2019;41:437-447. DOI: 10.1111/ijlh.13042.[15]Multicenter evaluation of the cobas m 511 integrated hematology analyzer[J].Int J Lab Hem,2018,40:672-682. DOI: 10.1111/ijlh.12903.[16]Beckman Coulter Iris尿仪介绍：https://www.beckmancoulter.cn/bdx/bdx_iris/.-End-
（责任编辑：dawenwu）
显微镜数字化成像技术在临床检验医学中的应用
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