李文辉实验室早先发现了乙肝病毒受体钠离子 – 牛磺胆酸共转运蛋白 (NTCP),并由此建立了高效的 HBV 感染 HepG2-NTCP 细胞模型。在此感染系统上,作者发现 HBV 感染 24 小时即可检测到 HBV cccDNA 的形成,几天后其拷贝数升高随后保持相对稳定,每个感染细胞内 cccDNA 拷贝数平均为 3 个。与 DHBV cccDNA 不同,HBV 细胞内扩增途径补充 cccDNA 的效率不高,cccDNA 池主要由初始感染的病毒将病毒基因组 rcDNA 转变为 cccDNA 而建立。进一步运用遗传学手段和小分子抑制剂进行实验,结果表明 HBV cccDNA 的初始形成不依赖于病毒聚合酶。随后通过靶向 RNAi 筛选实验,发现宿主细胞内 DNA polymerase κ(POLK), DNA polymerase λ(POLL) 和 DNA polymerase η(POLH) 参与了 HBV 感染,其中敲减 POLK 显示了最显著地抑制 HBV cccDNA 形成的效果,病毒核衣壳蛋白 (HBc) 和 3.5kb vRNA 的表达水平也显著降低。借助 CRISPR/Cas9 技术敲除 HepG2-NTCP 细胞中 POLK 的表达,进一步确认了 HBV cccDNA 形成过程需要 POLK 的参与。而敲除 POLK 没有影响丁型肝炎病毒 (HDV) 的感染和胆酸盐的转运。在 POLK 敲除的 HepG2-NTCP 细胞中过表达 POLK 即可恢复 HBV cccDNA 的合成和病毒蛋白的表达。该研究有力地表明在 HBV 感染 HepG2-NTCP 细胞模型中 POLK 是 HBV cccDNA 形成的关键细胞分子;同时提示在抗 HBV 治疗中,降低 cccDNA 需要有效阻断从头感染。该研究还为进一步揭示 HBV cccDNA 形成的分子机制奠定了良好的基础,HBV 感染 HepG2-NTCP 细胞模型也将推进 HBV cccDNA 生物学的研究步伐,为开发针对乙肝病毒慢性感染的新疗法提供新的线索。
北京生命科学研究所和北京师范大学联合培养博士生祁永和为本文的第一作者,其他作者包括郜振超,徐广伟博士,彭博,刘晨萱,严欢博士,姚奇艳,孙国梁,刘阳,汤定斌,宋子林,何文辉博士,孙银燕博士和郭巨涛博士。李文辉博士为通讯作者。该研究由科技部 973 项目,国家自然科学基金和北京市科委资助,在北京生命科学研究所完成。
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