气膜实验室大规模新冠筛查异常扩增曲线分析

作者：王思思1，王泽友2指导专家：唐玲丽2单位：1.湖南省脑科医院；2.中南大学湘雅二医院2019年12月底新冠疫情爆发，新冠核酸检测逐渐与我们的学习、工作、生活息息相关、密不可分。进入2022年，奥密克戎变异毒株出现，全球进入新一轮新冠疫情危急时刻。笔者随湖南省支援吉林核酸检测队结束在长春气膜实验室的40天核酸检测工作。在新冠核酸扩增结果判读过程中，我们会遇见各式各样的异常曲线。本文就2022年3-4月吉林长春体育中心气膜实验室所遇见的异常曲线，做一个经验分享与探讨。01前  言随着国内新冠肺炎疫情防控措施的加大，常态化核酸检测筛查力度和检测范围的持续加强，现已建立了大量专业的PCR实验室、储备了大量专业的核酸检测人员用于新冠疫情的防控。实时荧光定量PCR技术的基本原理也已被核酸检测工作者所熟知。然而，在第一次进入气膜实验室工作之前也应当做好充足的功课。01熟悉所用仪器的性能在大规模筛查期间，临时组建的气膜实验室的仪器来源可能由多家实验室提供，可能品牌多样，应熟悉每一款仪器的性能。了解每款PCR仪的荧光通道，使用的光源，采光方式，降温速度，软件操作等。本次长春气膜实验室使用了3个品牌仪器，其中2个品牌PCR仪为侧壁采光，故必须保证管壁透明，管盖形状（平盖、圆盖、凸盖）及透光度（透光、磨砂）均可用，也可在管盖做标记，不影响荧光采集及最后结果判读。有1个品牌的PCR仪为顶部采光，故必须保证管盖透明。而本次长春气膜实验室使用了透明封口膜，随着PCR反应的进行，封口膜会因受热形成凸起，会影响仪器采光。02分析所选试剂的特点气膜实验室可能同时备有多品牌的核酸检测试剂，有主检测试剂及高灵敏度的复查试剂。了解每个品牌试剂检测所使用的荧光探针及其对应标记的靶基因，扩增程序，扩增试剂组成及分样量，核酸加样量等。本次使用2个品牌试剂，作为常规筛查试剂的品牌1为42个循环，但前10个循环没有收集荧光，后32个循环采集荧光，故其实验结果Ct值≤32。作为复查试剂的品牌2为45个循环，从第一个循环即开始采集荧光，故其实验结果Ct值≤45，且其核酸加样量为20微升，提高了检测灵敏度。但如若未充分混匀会造成荧光曲线异常。03了解不同品牌仪器及试剂组合的扩增时间因仪器的性能不同，同一品牌扩增试剂在不同仪器的扩增时间会有差异。了解扩增时间，有利于大规模筛查时的时间调控及仪器分配，有利于提高效率。02异常曲线分析在吉林长春气膜实验室工作的40天，笔者现将核酸检测过程中碰到的异常曲线进行分析，如有描述或者解释不当之处，敬请各位同仁指正。01直线斜飘型01曲线特点：曲线无典型“S”型扩增，呈现为斜直上飘的特点。02原因分析：该类型曲线反应孔多数会出现液面偏低情况，可能是扩增试剂分液不准确，或反应孔气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加。03解决方案：配置试剂时注意检查试剂液面，核酸加样后用力压实封好反应板，上机扩增前再次检查有无缝隙。02倒“S”型原始曲线图：基线调整后曲线图：01曲线特点：曲线如倾倒的“S”型，呈现先下降再上升后下降的特点，形似光滑的波浪状。02原因分析：仪器的自动基线设定为6-12循环，因样本病毒核酸载量高，扩增曲线起跳早，位于或早于基线循环处，导致曲线异常。03解决方案：该类型曲线需手动调整基线范围，将基线设定前移至合适循环，重新分析。03小“S”型01曲线特点：曲线呈现出不典型的“S”型，有极短的对数扩增上升期，后进入平台期，荧光强度高于阈值，但远低于正常扩增曲线荧光强度，多见于顶部采光的PCR仪。02原因分析：该类型曲线可能为使用的PCR反应板封膜在PCR过程中受到水蒸气的影响产生变形，引起“光学扭曲”现象；也有可能是反应液中有气泡，气泡可以让光路发生折射，在气泡破裂时引起荧光信号急剧变化，干扰仪器对荧光信号的采集。03解决方案：建议采用质量好、加热不易变形的封板膜；核酸加样时尽量避免产生大的气泡，上机扩增前观察溶液是否有气泡并尽量弹破后再离心上机。04V型/倒V型01曲线特点：扩增曲线呈现为V型或是倒V形状，多见于PCR反应板四周边缘孔位。02原因分析：该类型曲线反应孔多数会出现液面偏低情况，甚至该孔无液体（上机前检查液面正常）。可能是PCR反应板封板膜未盖严，或加热变形，膜上翘导致液面蒸发。03解决方案：建议采用质量好、加热不易变形的封板膜；核酸加样后用力压实封好反应板，上机扩增前再次检查有无缝隙。05内标离散型内标离散扩增曲线：正常内标扩增曲线：内标离散扩增曲线：正常内标扩增曲线：01曲线特点：内标扩增曲线呈现开花散开式，扩增曲线不集中，各孔高低异常不平，呈离散型分布。02原因分析：本次气模实验室出现此类扩增曲线原因为新批号提取试剂存储环境温度较低，导致提取试剂内形成盐离子结晶物，影响核酸提取效率，而引起内标曲线扩增异常。03解决方案：关注试剂存储及使用条件，避免意外事件发生。06低荧光值型峰值低、大部分内标无曲线正常内标曲线图01曲线特点：整板内标扩增曲线多孔未起跳，起跳的内标曲线呈现峰值低的情况。02原因分析：耗材不匹配导致。该品牌扩增仪为顶部采光模式，而PCR板使用了透光性不佳的硅胶封口膜，影响了反应孔荧光信号收集，导致多孔内标未起跳，起跳孔荧光峰值低的异常结果。03解决方案：了解使用仪器的性能，选用适配耗材，更换为透明耐高温的透明封板膜。07V型转S型曲线异常曲线图：充分混匀后曲线图：01曲线特点：扩增曲线呈现为扩增初期曲线下降并有折点，随后逐步上升为S型扩增曲线。02原因分析：该品牌试剂加入核酸量为20微升，扩增试剂与加入的核酸未充分混匀，液体内核酸分布不均一，导致信号的不稳定，且该试剂程序从第一个循环即采集荧光。故能明显检测到荧光信号变化。随着高温循环的次数增加，样本和反应液开始混匀，荧光信号就变得稳定，出现正常S型扩增曲线。03解决方案：上机扩增前充分混匀并充分离心。08平波浪形型异常扩增曲线：隐藏内标后曲线：01曲线特点：扩增曲线呈现出与基线重叠的锯齿波浪状。02原因分析：反应孔未加扩增反应液。为配置反应试剂时，因吸头松动或人为疏忽等原因导致反应孔中漏加反应液所致。03解决方案：关注分液器与吸头的匹配度，分液完成之后检查反应管中液量。9基线平直型01曲线特点：扩增曲线呈现出光滑平直的直线，与基线水平平齐，无内标扩增曲线。02原因分析：出现此类情况，提示反应孔中无核酸，可能原因（1）反应孔漏加核酸，仅有扩增反应试剂；（2）因采样不合格、漏加样本等情况导致的反应孔核酸提取液未含有核酸。03解决方案：检查反应孔液面，若为漏加核酸，则使用原核酸样本重新加样扩增；若未漏加核酸，确认原始标本为混采还是单采，将标本重新抽提核酸再扩增检测，一般混采标本可出现正常内标扩增曲线。而单采标本可能由于采样原因扩增失败，此时需重新采样。10质控单跳型01曲线特点：阳性质控单基因起跳，阳性质控失控02原因分析：（1）第三方质控与扩增试剂不匹配；（2）错用不同品牌的质控品，扩增片段不同，与扩增试剂不匹配；（3）同一品牌不同批号的质控品混用，扩增片段可能存在批间差异；（4）质控品保存不当造成降解，或者处理不当造成基因片段浓度不均匀，如用前没有充分混匀。03解决方案：首先确认所使用的质控品是第三方质控品还是试剂盒自带质控品，若为第三方质控品，如为首次跟该品牌扩增试剂匹配使用，则首要考虑质控品与试剂的匹配问题，如之前已使用，则主要关注质控品保存和批号；若为试剂盒自带质控品，则主要关注质控品保存和批号，同时确认是否误用其它品牌试剂质控品。03总  结新冠疫情自爆发以来已有三年之久，无论是新冠核酸检测实验室，还是核酸检测人员都已在新冠检测的方方面面积累了大量经验。也不断有人分享实验流程优化、实验室的质量保证、异常曲线分析等经验。笔者结合此次长春气膜实验室的异常曲线情况，总结如下：（1）加强人员培训，强化要点及细节。综合分析以上异常曲线，部分异常曲线的产生与人员的操作相关。在大规模核酸筛查的高强度工作背景下，加强人员培训，专人专岗，关注细节，强化训练，是保证检测质量的关键。（2）大浪淘沙，筛选匹配试剂、耗材。3年抗疫，多轮筛查，各家实验室已经有自己一套的优质的耗材、试剂品牌，因试剂、耗材的本身质量问题而产生的异常曲线很少。与其相关的异常曲线多为人为选择失误或是偶然事件。（3）关注仪器状态，监控试剂存储，关注细节。中国幅员辽阔，南北气候环境差异大，导致临时搭建的气膜实验室所处环境不同。应结合当地特点，充分考虑环境因素，避免意外情况发生。同时大规模筛查的频次和密度，对于仪器状态的是一个大考验。应关注仪器突发状况引起的异常曲线。04专家点评点评专家：胡敏 教授中南大学湘雅二医院检验医学科主任核酸检测在本轮新冠疫情的防控工作中发挥了前沿哨兵的作用。实践证明，全民大规模检测是有效识别感染人群和无症状病毒携带者的重要一环；但大规模的核酸检测由于工作量大，检测人员多为临时组成的团队，加上人和设备均超负荷运行等原因，会出现各种原因引起的异常扩增曲线出现，影响检测结果的判读。本文作者总结了在援吉林长春近50天的大规模检测工作中发现的几种异常扩增曲线，通过描述每种异常曲线的特点，分析了异常曲线出现的原因，并针对每种原因提出了解决方案；本文思路清晰，逻辑严谨；作者从人、机、料、法、环、测六个方面进行根本原因分析，解析了在大规模核酸检测这一特殊的场景下，如何保证检测质量的思路和做法，对保证核酸大规模检测结果质量具有很好的指导价值。点评专家：邹国英 教授湖南省脑科医院（湖南省第二人民医院）医学检验科主任本文作者是湖南省脑科医院（湖南省第二人民医院）临床分子生物学组技术骨干，先后参加了河南安阳、吉林长春的抗疫工作，积累了丰富的实战经验。文中介绍了10种PCR异常曲线，从曲线特点、原因分析及解决方案进行了剖析，强调结果分析的重要性，提示加强人员训练，筛选优质的试剂和耗材、关注细节是保证检测质量的关键。文章内容丰富实用，分析到位，值得PCR检测人员借鉴学习。点评专家：周细国 教授湖南省援吉核酸检测总领队、湖南省临检中心党支部书记新冠大规模筛查实验中，特别是高风险地区的大规模筛查中，会碰到多种异常的扩增曲线，如何能够快速判断曲线异常的原因，保证核酸检测结果的快速、准确发布，是一个重要环节。本文作者从实际工作出发，介绍了10种筛查过程中碰到的异常曲线，剖析了其原因，并提出了解决方案。对于各位同仁是一个很好的借鉴和参考，有助于进一步提升核酸检测能力，指导检测结果的判读。这种实战经验总结分析，值得各位同仁学习和借鉴。本文作者在工作中不断学习和总结的精神，同样难得贵！END
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