男性不育精液检查研究进展

作者：孙烁磊    作者单位：北京大学深圳医院，广东 深圳 518036
    近20年来，男科学的研究有了长足的进步，男科也作为一个学科从泌尿外科中独立出来。在男科学中，男性不育是一个重要内容，而精液检查是诊断男性不育的重要手段，随着研究的深入及细胞分子生物学技术、计算机技术等的迅速发展，原有的检查方法不断得到改良，新的诊断技术和设备也是层出不穷，一些检查指标的相关机理有了合理的解释，使得我们对男性不育机制的认识更加深刻、全面，对不育原因的分析更加准确、可靠。为了对男性不育的精液检查有进一步了解，现将近年来原有检查方法的一些改进以及新出现的检查手段作一个大概的介绍。
　　1  常规精液检查的主要指标及研究进展
    精液常规检查是最为简便实用的方法，可了解由精液因素所致的不育，对指导下一步的检查和治疗提供重要依据，避免了女方过多的、不必要的检查。近年来精液检查各项主要指标的研究均有一定进步，特别是计算机辅助精液分析系统及新的检查方法进入临床检验使精液分析更加快速、简便、准确、直观，更加具有临床价值。
    根据世界卫生组织（World Health Orgnization，WHO）《精液及精子一宫颈黏液相互作用实验检查手册》(第3版)［1］精液常规分析主要指标有。
　　1.1  精液量 
　　检测精液量的方法有刻度量筒法和称重法，因称重与精液密度有关，故以刻度量筒法较为准确。
    精液量的多少男性生育能力有一定关系。成年男子每次射出的精液量正常为2 ml～6 ml，与排精的间隔时间、营养状况、个体差异、生殖器官功能有关。精液量随年龄也有一定的变化规律［2］。如每次射出的精液量少于2 ml，即为精液过少，可以由于性交次数过频、精液的产生和贮备不足引起，因此，精液检查前应禁欲3 d～7 d。精液量过少引起不育或生育力低下的机制有： 精液量过少，不能充分中和阴道中的酸性分泌物，影响精子的生存与活力；精浆中的果糖等成分，可为精子活动提供能量，精液量过少，不能维持精子足够的营养，影响精子的活力；精液量过少，性交后不能在阴道后穹窿形成足够的精液池，不利于精子上行进入女方子宫颈管。
　　1.2  精子总数 
　　精子总数是判断男性生殖能力的主要指标，正常成年男子每次射精其精子总数为4亿～6亿。当每次射精其精子总数低于1亿时定义为少精子症。精液中没有精子则称为无精子症。因精子数量过少而受孕机会降低。少精与无精主要有各种原因为造成的生精阻滞(精索静脉曲张、泌尿生殖道感染、营养、内分泌等)、生殖道不完全性梗阻、遗传因素等。其中有50％原因不明，为特发性无精、少精症。精子计数同时也受一些因素影响，例如年龄大小［2］、使用手机的时间、吸烟、季节变化、农药及杀虫剂等等。
　　1.3  精子密度 
　　精子密度检查方法有血细胞计数板、Macro计数板（类似Mackle计数板）、Cell－VU计数板，WHO推荐血细胞计数板作为金标准，但是该法不能同时进行精子活力测试，且结果较真实值偏高。Macro计数板则是CASA的配套产品，可同时进行精子活力分析。最近引进国内的Cell－VU则测试数值最接近真实值，而另外两种测试方法均明显增高。Cell－VU可一次性或多次使用，在检查传染性强的标本时有独特优势。相对于保证测试结果的准确性和进行精液质量控制来说，Cell－VU计数板方法应该是最理想的。精子密度也与男性生殖能力相关，正常成年男子精子密度应>20×106/ml，若低于该值，即为精子密度过低，可能原因为精子总数正常而精液量过多稀释或精液量正常而精子总数下降所致。精子密度同时受精液量和总精子计数的影响，任何影响这两个指标的因素均可以影响精子密度的变化。
　　1.4  液化时间 
　　正常精液标本在60 min内液化，且在15 min内完成，若超过60 min不能完全液化，则称为精液液化异常。液化异常可影响精子的活动，降低精子活力，导致不育［1］。人类精液具有凝固并在短时间液化的特点。正常男性的精液刚射出时呈稠厚的胶冻状，有利于精液在女性阴道中停留，随后开始液化，有利于精子活动。这个过程由精液中的凝固和液化因子来调节，前者主要来源于精囊，后者主要来源于前列腺。当液化与凝固因子间的平衡被打破，精液可表现为液化异常。液化障碍多与精囊和前列腺炎症、先天性畸形或性腺功能异常有关。    　　根据形态学及生化分析将精液液化分为三个阶段：第一阶段为肉眼下凝胶状物质的溶解以及超微结构下球状颗粒的消失；第二阶段为溶解的蛋白质降解为肽；第三阶段为肽降解为氨基酸。
    参与精液凝固及液化的因素有:Semonogelin(Sg): 包括Semonogelin I(SgI)和Semonogelin Ⅱ(SgⅡ)，他们是男性精囊液和精液凝胶中的主要成分，由精囊腺上皮分泌，是20号染色体上不同基因的产物，主要功能是使精液射出后立即呈凝胶状态，抑制精子运动, 可作用于完整精子的鞭毛，对精子的活率、速度具有可逆且浓度依赖的抑制作用［3］。；前列腺特异抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)：由前列腺上皮细胞合成，为丝氨酸蛋白酶，编码PSA的基因位于19号染色体长臂［4］，属腺体分泌的激肽释放酶基因家族。PSA是精浆中最丰富的蛋白酶，其生理功能为降解精液凝胶中主要蛋白(sgI、sgⅡ及纤维连结蛋白)，使精液在5 min～15 min内液化［4，5］；参与该过程的其他成分：纤溶系统的某些成分、其他蛋白酶类、金属离子也参与到这个精液液化的过程。以上因素如果存在异常，均可影响精液的液化过程，影响精子活力，导致不育。
　　1.5  精液pH值 
　　检测精液pH值一般采用pH试纸法。正常情况下精液pH值处于7.2～8.0之间，是精子活动的最佳环境。pH值过高或过低均对生育能力有所影响，特别是当pH值偏酸时，精子的活力和代谢均下降。pH值为6.0时精子活动停止。偏碱性的精液可中和阴道酸性分泌物，保护精子正常活动，但当pH值>9.0时精子活动与代谢下降。当附属性腺感染时，精液pH可>8.0，结合精浆弹性蛋白酶含量的检测可提高诊断感染的准确度；当输精管梗阻或精囊腺病变时，精液pH可下降。精液的pH值在不育男性患者能够部分反映男性性腺及附属性腺的发育和功能状况，对分析病因很有意义。
　　1.6  精子正常形态率 
　　目前使用的精子形态学分析有6种方法：改良巴氏染色法、苏木精－伊红染色法、瑞氏染色法、瑞－吉氏染色法、Diff－Quik染色法和Shorr染色法。基于不同染色法对精子头部大小的影响、染色效果及操作简易与否，Diff－Quik染色法和Shorr染色法值得推荐。
    正常精液的精子正常形态率≥30％［1］。但正常精液也有异常形态的精子，当异常精子数量超过40％为畸形精子症。    　　精子形态与精子活力的关系：很多外界因素，如激素［6］、细胞因子［7］、氧自由基［8］、某些基因［9］、杀虫剂［10］、微量元素［11］、禁欲时间等，都会引起精子形态异常及精子活动力降低。这些因素同时作用于精子形态和精子活动力，所以两者变化常相伴产生，而前者对后者的影响可能只是次要原因。精子形态异常时精子运动表现为，曲线性上升，直线性下降，动态参数表现为VCL、VAP、ALH、WOB升高，而MAD、LIN、STR降低，VSL也有下降趋势，另外，颈部中段异常引起的精子机能和形态改变对精子运动特征影响较小。
　　1.7  精液白细胞计数 
　　检验精液白细胞的方法有4种。直接镜检法：简便易行，但有时与生精细胞难以区分；过氧化物酶染色法：受细胞成熟度及涂片技术等影响；荧光原位杂交法：可根据杂交信号的数目和位置，结合细胞核特有的形态对白细胞进行鉴定；免疫细胞化学法：根据白细胞表面标志，用抗白细胞及其亚群的单克隆抗体结合酶标记进行反应，此为目前检测白细胞的最可靠的方法，但操作复杂，试剂昂贵，而且因其灵敏度高，阳性率也相应提高，故诊断标准亦应作相应修改。
    正常精液白细胞计数<1.0×106/ml，白细胞增多，常见于感染、自身免疫性疾病、吸烟、酗酒等患者。当精液白细胞计数超过1.0×106/ml时诊断为白细胞精子症［1］。在男性不育病因中约占10％～20％［12］。但精液白细胞增多并非导致不育的直接因素。而是伴随着精液白细胞数的增多，白细胞产物（如干扰素、肿瘤坏死因子等）浓度升高，才表现出对精子的损伤作用，引起精液参数变化及精浆抗氧化能力下降。     精液白细胞在吞噬过程中产生活性氧(超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等)［13，14］，损伤精子膜、膜酶，损伤线粒体，使ATP生成减少，精子活力下降，同时引起精子染色质异常和DNA损伤，影响穿透卵子的能力；大量白细胞在附睾、前列腺上皮浸润，引起附属性腺功能障碍，精浆成分异常，液化与凝固因子比例失衡，影响精子在生殖道中的运行和成熟；IL8、γINF和TNFα使精子运动能力降低；TNFα还可启动细胞免疫，抗精子抗体产生增多，增强白细胞对精子的损伤［7］。 　　1.8  精子活动力  　　精子活力指精子前向运动的能力。精子应有良好的活动力才能通过女性生殖道到达与卵子结合的场所实现受精。为便于操作将精子活力分为a、b、c、d 4级［1］：a级：为快速前向运动，即37℃时向前运动速度≥25 um/s，或20℃时≥20 um/s。b级：为慢速或呆滞的前向运动，向前运动速度介于a级与c级之间。c级：为非前向运动，即37℃时向前运动速度<10 um/s。d级：为无运动精子，即37℃时向前运动速度为0 um/s。    通常说的精子活动率是指a、b、c三级活力百分率的总和。而临床上只有前向运动的精子才有可能到达受精的位置。WHO将a级≥25％ 或a+b级≥50％作为正常精液精子活力的参考值，未达上述指标称为弱精子症。此外，精子活力与温度相关，所以进行活力评估时，应使温度恒定，一般维持在37℃。此外精子活力也受年龄、禁欲时间、生活习惯、季节、许多因素的影响。弱精子症，是男性不育的首要病因［1］，其原发病因很复杂，精索静脉曲张、泌尿系感染等均可引起。     精子活动力的检测有手工分析及CASA系统分析两种方法。但因为手工分析带有较大的主观性，对精子运动能力缺少量化标准，误差大，且精子活动力受时间和温度的影响较大，手工分析时这种影响会更大，不作为标准化的方法被推荐。     计算机辅助精液分析（Computer Assisted Semen Analysis，CASA）是利用录象机或摄象机和计算机视屏技术产生的新技术，通过摄象机与显微镜连接，确定和跟踪个体精子细胞的活动，并将所获得的电子信号输入计算机，通过分析，除了可以给出常规参数外，还可测定描述精子细微运动方式的动态参数。弱精子症患者的动态参数会有一定程度的改变。     CASA测定的动态参数：平均路径速度(VAP)：在CASA中就是以精子沿轨迹曲线行走的平均速度将精子运动速度将精子活力分级的。同样分为a、b、c、d四级；曲线速度(VCL)：精子头部实际行走的轨迹路径速度；直线速度(VSL)：精子头部呈直线移位的前向运动速度。鞭打频率(BCF)：精子头部跨离精子运动路径的频率。     精子运动方式参数：直线性(LIN)：表明精子实际的行走路线的曲折程度；前向性(STR)：表明精子平均移动轨迹的曲折程度；摆动性(WOB)：表明精子实际运动轨迹相对其平均路径摆动的程度；侧摆幅度(ALH)：表明实际运动轨迹相对平均移动轨迹的偏离程度。     CASA与人工方法比较的优点与缺点［15］。优点： 显著地提高工作效率，降低人为误差，动态指标的检测更客观、更精确；将计算技术与图案处理技术进行了有机结合，动态地进行运动观测，并能提供精子动力学的量化数据；检测的速度快，捕捉的信息量大。缺点：受设备价格昂贵、实验室条件等因素限制，较难普及；评估精子密度的精确度还受精液中细胞成分和非精子颗粒物质影响；c和d级精子不易区分；CASA系统设置缺乏统一的国际标准，不同厂商和型号的系统分析结果可比性差，尤其是精子密度和活动率。     近年来，CASA技术也不断的得到改良，出现了DNA荧光染色CASA，为精确测定精子密度提供了可能［16］，虽然对精子形态学的自动分析尚未十分完美，但对比手工法仍更加准确。另外，也有人将CASA作为预测男性生育能力的工具［17］。 　　2  其他精液检查方法 　　2.1  精浆生化检查  　　精浆中的一些生化标志可反映男性生殖系统等，有利于综合评价不育的发病原因和机制。由于相对简单易于操作，某些项目已成为实验室的常规检查。     游离左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和中性α葡糖苷酶可反映附睾功能。中性α葡糖苷酶是附睾分泌功能的指标，较其他两种检测更特异、更灵敏。结合激素等其他指标，对远端输精管阻塞有较好的诊断价值，是诊断梗阻性无精子症的理想方法。     精液果糖由精囊腺产生，可反映精囊腺功能。有苯二酚显色法、气象层析法、吲哚显色法三种测定方法。其中苯二酚显色法因操作简单、特异性好最常应用。精囊腺功能紊乱时，精浆果糖含量降低，进而引起精子能量不足，活力下降。先天性无精囊或精囊发育不良所致无精症者，果糖为0或微量。单纯输精管阻塞性无精症者，果糖含量正常。果糖和中性α葡糖苷酶葡糖苷酶两者相结合，可大大提高对梗阻性无精子症的诊断。     柠檬酸、锌、镁、谷氨酰转肽酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶检测已成为男科实验室的常规检查，常用磷酸苯二钠法。     男性生殖道感染时，分叶核粒细胞参与吞噬病原体等抗炎反应时分泌于精浆的弹性蛋白酶，作为静止型生殖道感染的诊断及愈后检测指标的可靠性，得到了WHO的认可。     也有学者［18］发现精子症患者的精子悬液的肌酸激酶(CK)水平明显高于正常生育男性；而严重少精子症患者(精子密度<5×100/ml)CK水平显著升高，以精索静脉曲张的患者升高最明显，提示精浆CK可作为精子质量和成熟的敏感指标，CK 升高的水平与异常功能精子增加率和胞浆潴留增加有关。 　　2.2  精浆细胞因子的检测  　　精浆细胞因子由男性泌尿生殖道内的各种细胞分泌，包括转化生长因子、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、各种白细胞介素(IL)及某些可溶性受体等。目前认为，与男性不育有关的细胞因子主要有IL6和IL8，不育患者精浆中IL6和IL8水平明显高于生育力正常的男性。测定IL6和IL8的方法有：生物学方法、分子生物学方法和免疫学方法，以免疫学方法多用，尤以ELISA和RIA常用。 　　2.3  精浆总抗氧化能力测定  　　总抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)代表体内酶类和非酶类抗氧化物的总体水平，各抗氧化物质之间有着相互联系，起协同保护作用。梗阻性、非梗阻性无精子症患者、少精子症患者、弱精子症患者和少弱精子症患者的精浆TAC水平明显低于正常生育男性。其水平与精液活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)相关。ROS是一类具有比氧更为活跃化学反应性的氧代谢产物及其衍生物，主要包括O2- 、H2O2、OH-等。通过损伤精子细胞膜、线粒体、染色质，破坏精子结构，使精子运动相关的酶失活，引起精子数量、形态、运动、顶体反应异常。目前研究认为除了原发性的因素以外，影响精液TAC及ROS因素主要有：精液中的白细胞、精索静脉曲张、慢性前列腺炎和过度吸烟(>20支/d)等，这些患者精浆TAC水平均有所下降［19］，精液中的白细胞能使ROS增高，TAC水平下降［13］。精索静脉曲张患者精浆中TAC水平显著降低［20］，慢性前列腺炎患者精浆中TAC水平显著降低［21］，过度吸烟的不育男性精液中ROS增多，而TAC水平下降［22］。　　　　2.4  精液顶体酶活性测定 
　　精子顶体酶是存在于顶体内的一种蛋白水解酶，以酶原形式合成并储存在顶体内，发生顶体反应时，顶体酶原释放，为精卵结合提供条件。精子质量与精子顶体酶活性有很好的相关性［23］。精子顶体酶活性正常与异常的精液，其精子密度、活动率、活力等参数均有显著差异。这三个指标越高，精子顶体酶活性越高。而在精子顶体酶活性降低的精液中，精子的活动率降低，a级精子明显减少，而活力差的d级精子明显增多。少、弱、死精子症患者的顶体酶活性显著降低。
　　2.5  双向蛋白电泳［24］ 
　　国内有人利用双向电泳方法对比分析了弱精症患者及正常生育男性的精液，均出现了7条蛋白带，但其中2种蛋白在弱精症患者中高度表达，而另外5种恰恰相反。说明某些蛋白在弱精症患者中特异性表达，具体情况有待进一步研究。
　　2.6  流式细胞学检查［25］ 
　　能提供人工检查相同的精子计数、精子活力、活动率、圆形细胞计数、抗精子抗体等指标，但是更加准确。
　　2.7  精子染色质结构测定（sperm chromatin structure assay，SCSA)［26］ 
　　可以作为常规精液分析的补充，发现一部分常规精液检查无法检查到的核型异常。
　　3  讨论
    精液质量控制是热点问题，国内及国外均有报告表明，由于采用的检验方法、设备、标准和检验人员的水平等多种客观或人为因素的影响，造成了各实验室间检验结果存在很大的变异，即使是同一个实验室同一份精液，检查结果也可能存在明显差异，实验间难以进行比对，同时也对进行大范围、多中心、不同实验室进行统计分析造成一定困难，精液分析的可信度受到质疑。于是进行精液质量控制被提上日程，并付诸实践。国外早在20年前就提出了精液质量控制的观点，并且在某些地区已经取得了一定成果，国内近些年也越来越重视精液质量控制。经过一段时间的实践，人们总结出以下几点建议［27］： 所有实验室应该采用普遍接受的检测标准和指标；所有实验室应该参加室间测评计划；实验室应该执行有效的室内质控和质量保证计划，以保证报告结果准确和可重复；临床医生应该指定患者在严格执行上述建议的实验室接受精液分析，或只认可这些实验室提供的精液分析结果。实践证明，精液质量控制对精液分析标准化是有效果的。然而最近，提倡精液质量控制的先驱者之一Anne Jecquier［28］从临床医生的角度提出了不再需要精液质量的观点，认为只需要进行适当的精液检查，而不必要仍然坚持耗费时间和金钱的精液质量控制。有人支持，当然也有人反对。总的来说，精液质量控制的成果是可以肯定的，有利于提高精液检查的准确性，有利于进行实验室间的比较，有利于进行大规模、多中心的研究，仍需要继续实行、推广，但由于各个实验室的客观条件不同，精液检查应用的目的不同，不可能强求一律严格按照科学研究的标准执行。对于进行科学研究的实验室，保证能够得到准确的结果是最重要的，所以要严格按照标准执行。对于一些临床诊所，仅需要对精液情况进行分析，为生育能力评估提供参考，不必要过于拘泥，造成财力及时间的浪费，但仍然需要精液质量控制，以免过于宽松而影响精液检查结果的可信度。
    男性不育是最常见的人类生育失败的原因之一，虽然对精子生理学和精子与配子相互作用的生物学过程的研究已取得很大进展，原有的检查方法得到一定的改进，各种各样的检测方法也层出不穷，但这些方法在简便性、经济性、实用性、可靠性方面尚待进一步提高，各实验室检查质量控制的实施也存在差距，而且目前仍缺乏预言精子特征十分准确、与配子受精能力密切相关的诊断技术，仍需进一步改善检查技术，寻找新的检查方法，做好精液质量控制。
 
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