肿瘤NGS伴随诊断的创新审批之路

2014年2月7日，国家食品药品监督管理总局（CFDA，现国家药品监督管理总局CNDA）发布《创新医疗器械特别审批程序（试行）》，自此开启了医疗器械审批的“绿色通道”。同年，华大基因的BGISEQ-1000基因测序仪、BGISEQ-100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（联合探针锚定连接测序法）、胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（半导体测序法）批准上市，而由中山大学达安基因股份有限公司申请的胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒（半导体测序法）通过创新公示并最终获批，标志着无创产前诊断NGS正式获得临床准入资格。NGS除在产前诊断外，在肿瘤个体化诊疗、遗传病筛查、健康管理方面都有巨大潜力。因此，NGS一直是诊断领域的热点，但由于各种原因，产前诊断以外的其他应用一直未获得国家监管机构的认可，包括在美国，获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NGS项目也屈指可数。2016年到2017年，FDA相继批准了FoundationFocusTM CDx BRCA Assay、OncomineTM Dx Target Test、Praxis Extended RAS Panel、FoundationOne CDx等4项NGS伴随诊断产品。其中，Oncomine Dx Target Test成为首个基于多生物标记物伴随诊断试剂盒。为了探讨有关NGS研发、注册、审批等方面的热点问题，2018年1月定向点金邀请了FDA前NGS负责人Dr. Elizabeth Mansfield、审核审批Illumina MiSeq的主要负责人Dr. Cheng Zhang、国家临检中心副主任李金明教授、中检所黄杰教授等在海南三亚召开了“2018二代测序中美高峰论坛”，各位专家分享了自己的经验，与会者也纷纷提出了企业的困惑，并得到了专家的建议，会议反响热烈。近日，CNDA先后批准了两家企业的创新肿瘤NGS产品上市，使得NGS技术在临床诊断领域的应用得以进一步推广，我们也见证了CNDA在相关产品的监管审批上正在与FDA接轨。同时也慨叹肿瘤NGS伴随诊断产品这不平凡的创新审批之路。2016年8月，由中国食品药品检定研究院（中检院）组织制定了《第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则》，表明监管部门已开始着手于规范NGS技术检测试剂。文件中明确NGS检测试剂的检测流程包含样本收集、样本制备、测序、生物信息学分析及报告和数据库管理等五个环节，并提出了对于主要原材料及性能评价的基本要求。2016年9月，广州燃石医学检验所有限公司（以下简称燃石）生产的“EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）”作为中国首个肿瘤NGS检测产品进入“创新医疗器械特别审批程序”，经过近2年的时间，最终在2018年成功获得肿瘤NGS第一证。这次获批意味着NGS在肿瘤诊断领域实现了从LDT（实验室自建项目）到IVD（体外诊断产品）的跨越，让整个测序行业为之振奋。该产品依托Illumina公司的MiSeqDx平台，采用RNA探针捕获技术检测4种基因的13种变异，包括点突变、缺失及重排（融合）。其中EGFR基因19号外显子缺失（19del）、L858R点突变用于吉非替尼片和盐酸埃克替尼片伴随诊断检测，EGFR T790M点突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测，ALK重排（融合）用于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测。得益于医疗器械注册审评的改革措施，从国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心（CMDE）公开的审评报告中，企业人员可以获悉监管部门对于肿瘤NGS伴随诊断产品的关注点以及要求。通常来讲，针对该类产品，企业会在以下几个方面存在困惑：第一，企业参考品和质控品的设置；第二，分析性能评估的内容；第三，伴随诊断临床研究。而这份报告在某种程度上也给出了相应的提示：首先，对应性能指标设置企业参考品，包括阴性参考品、阳性参考品、重复性参考品和最低检出限参考品。参考品形式可以为临床肺癌组织样本，也可以为细胞系样本。一般来讲，对于常见变异选择临床样本建立阳性参考品，对于罕见变异，可选择细胞系来补充。参考品的验证选择数字PCR和Sanger两种方法。这里有两点笔者提醒大家注意，一是本次燃石申报的产品所涉及的变异位点并不多，或许是企业考虑到产品的伴随诊断临床意义以及监管的相关要求，因此其设置的各项企业参考品都覆盖了全部突变类型。然而，众所周知，NGS的特点是能够进行高深度、全面的基因测序，并且FDA具有批准肿瘤大panel的经验，曾任职于FDA的Dr. Cheng Zhang在2018年1月三亚举行的中美高通量测序高峰论坛上向与会者介绍过，在NGS检测开发阶段，对于参考物质可以选择代表性的变异以覆盖不同类型的变异类型、变异大小以及基因组区域。二是关于使用人造样本补充患者样本的情况，Dr. Cheng Zhang建议应进行样本可替换性研究，具体方法是建立常见突变临床样本的系列稀释水平，然后建立相同浓度（系列稀释）的常见突变细胞系，比较时可涵盖多种突变类型，进而评估并比较临床样本和细胞系之间的性能。其次，本次燃石提交的产品分析性能评估内容主要包括重复性试验、最低检出限试验、阴/阳性参考品符合率评估、分析特异性研究（干扰因素和交叉反应）、配套试剂盒的组合性能研究、肿瘤组织样本要求研究、不同规格试剂盒的分析性能验证。性能评估资料涉及2种规格的5批次产品，符合CMDE对于多批次（3批以上）性能评估的要求。而从FDA的监管经验以及已获批上市产品的安全有效数据综述（SSED）中可以看出，NGS检测常见的分析性能项目包括准确性、精密性、分析前准备如样本提取及样本质量等，灵敏度如空白限、检测限，DNA/RNA投入量、组织投入量、肿瘤含量等，特异性如干扰物质和交叉反应，稳定性如样本稳定性、试剂稳定性、储存效期、上机稳定性、运输稳定性等，另外，有效阈值/系统稳定性也是其中一项。企业可以根据自身产品特点选择适宜的验证项目。而NGS检测实际上是一个系统，因此需要对整个检测系统进行验证，即从样本收集、样本制备到测序流程中的各个步骤，以及结果报告的生成。最后，在伴随诊断临床研究部分，燃石采用了与已上市伴随诊断试剂盒进行比较研究以及TKI药物疗效相关的回顾性临床研究两种方式，这也与CMDE 发布的《EGFR突变基因检测试剂（PCR法）注册技术审查指导原则》中提及的有关突变基因个体化治疗相关临床研究要求相符，导则中规定“考核试剂应满足临床需求，申请人可采用基于特定药物研究观察终点的前瞻性队列或回顾性队列临床研究。同时，为保证其他临床研究效能，应考虑选用已联合特定肿瘤药物临床研究的体外诊断试剂作为全部或部分考核试剂检测结果的对比方法。”值得注意的是，由于回顾性研究中纳入的有效病例未完全符合统计学意义的要求，因此CNDA对其作出了附加条件审批，即要求该产品上市后应继续对产品伴随诊断用途进行验证。需在至少2家临床机构随访收集伴随诊断4种药物（吉非替尼、埃克替尼、克唑替尼、奥希替尼）的临床用药疗效随访数据，作为临床补充资料在产品下一次延续注册时提交。而盐酸厄洛替尼片（特罗凯）药效相关研究仅纳入8例有效病例，因此无法明确其与该产品的伴随关系而未获得相关批准。紧随燃石的产品之后，2018年8月，CNDA通过创新医疗器械特别审批通道，批准了天津诺禾致源生物信息科技有限公司（以下简称诺禾）“人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）”上市。该产品覆盖与非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗用药相关的6个基因，包括点突变、插入缺失、融合等多种变异形式的检测。其中，EGFR基因19del、L858R点突变用于吉非替尼片伴随诊断检测（此一项燃石的产品所声称的靶向还包括盐酸埃克替尼片），T790M突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测，ALK融合和ROS1融合用于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测。此试剂盒选择了达安的DA8600基因测序仪作为适用平台，相信也是考虑到该平台已于2017年通过变更增加了“对人体基因位点的检测”，而反观燃石依托的是尚未获得CNDA批准的Illumina平台，率先突围的2项产品实际上也是Illumina和Life（Thermo Fisher）两大平台之争。从产品的主要组成我们也能看到平台之间技术路线的差异以及两家公司所选择的不同注册策略。从公开的审评报告可以了解到，诺禾采用的技术平台也是FDA批准的首个基于多生物标记物伴随诊断试剂盒OncomineTM Dx Target Test所适用的平台。OncomineTM Dx配合FDA已批准Ion PGMTM Dx系统，可检测来自NSCLC患者的福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤（FFPE）组织样本中分离的DNA和RNA中23种基因的序列变异。其中包含3种伴随诊断标志物（分别为BRAF V600E、ROS1融合以及EGFR的L858R和19del）。据ThermoFisher法规与临床总监Lynne介绍，产品的递交采用的形式是模块型PMA（Modular PMA），在整个申请过程中，始终与FDA保持沟通，整个递交过程耗时12个月。而其团队也正在积累数据，准备进一步申请扩展panel的临床应用。诺禾的阳性参考品的设置同样采用了两种来源，包括临床样本和细胞系，而验证方法则选择了数字PCR和NGS。在分析性能评估方面，两项NGS产品在方法的选择上略有差异，并且由于技术原理不同，最终得出的分析灵敏度（检测限）也有较大差别。在临床评价部分，诺禾首选了Sanger测序来进行一致性的比较，样本总例数也达到2789例，可见其在产品临床验证上的投入。除此之外，考虑到Sanger测序本身的局限性，还选择了已上市qPCR试剂进行了部分比较研究，结果也是相当令人满意。在伴随诊断研究部分，同样的选择了Follow-on（与已上市伴随诊断试剂进行等效性研究）以及TKI药物疗效相关回顾性临床研究，从2项获批产品提供的数据可以看出，受制于阳性患者数量、临床样本可获得性等诸多因素，最终能够纳入回顾性研究的病例十分有限，很大程度上影响了审批，因此是否跟踪随访、与治疗药物共同开发会成为未来的发展趋势，从企业的角度如何布局肿瘤市场，从监管的角度如何保证产品的安全有效性的前提下实现灵活审批，还有很多问题有待思考和解决。随着监管部门开始认可肿瘤领域的NGS检测产品，除了上述已获批的2项产品，已进入“绿色通道”的其他同类产品，包括南京世和的肺癌靶向药物基因突变检测试剂盒（高通量测序法）、厦门艾德的人类癌症多基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）、厦门飞朔的人类肿瘤多基因变异检测试剂盒（半导体测序法）也正在审核过程中。行业竞争也将在产品上市后激烈展开。不仅如此，为了进一步规范肿瘤相关突变基因检测产品的注册申报和技术审评，提高审评效率，统一审评尺度，CMDE于8月14日发布了关于公开征求《肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用技术审查指导原则（征求意见稿）》意见的通知。体现出了监管部门对于NGS试剂盒产品的高度重视。而说到伴随诊断，还要提及2018年初获批的一个里程碑式的国产产品，即厦门艾德生物医药科技股份有限公司（以下简称艾德）生产的创新产品“人类EGFR基因突变检测试剂盒（多重荧光PCR法）”，该产品基于高灵敏的PCR专利技术，用于体外定性检测晚期NSCLC患者血浆DNA样本中人类EGFR突变基因，是我国首个批准的伴随诊断产品，也是国内第一个基于液体活检的肿瘤基因检测产品。通过该产品的审评报告获悉：第一，在企业参考品设置方面，其阳性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品采用临床EGFR突变阳性血浆样本DNA、质粒DNA、EGFR突变阳性细胞系DNA与阴性血浆DNA混合，经数字PCR定量制备而成。其中，阳性参考品和最低检测限参考品涵盖了全部突变类型。阴性参考品包含了EGFR突变阴性的血浆样本DNA、EGFR突变阴性而其它突变基因阳性的血浆样本DNA和非人类基因组样本DNA，经数字PCR和Sanger测序法验证均为EGFR突变基因阴性；第二，在分析性能评估方面，该产品基于多重荧光PCR的方法，不及NGS产品的检测流程复杂，因此仅针对核酸提取纯化试剂进行了配套验证，而其他性能如最低检测限、精密度、阴/阳性参考品符合率、特异性（交叉反应、干扰反应）则根据产品特点进行了相应验证。值得一提的是，经验证，产品的最低检测限为15ng/反应DNA浓度下0.2%-0.8%突变比例，也体现了液体活检产品对高检测灵敏度的要求。当然该类产品的性能还有待进一步提高；最后，在临床验证方面，该产品分三部分进行，一是与本公司生产的已上市试剂盒开展一致性研究，并采取NGS测序作为第三方验证方法；二是按照相关指导原则的要求，对于外周血样本类型，包括了至少200例肿瘤患者同源性外周血样本和组织学样本对比研究；三是EGFR-TKI药物疗效相关的临床研究，在这一部分，同样的，如果有效样本量未达到预期统计学要求，则不能够声称药物与产品的伴随关系，并要在产品说明书中作相关说明。可以说，2018年将注定成为医疗器械审评审批历史上不平凡的一年，这一年当中，我们见证了多项创新产品的获批落地，包括获得万千关注的肿瘤NGS检测产品、肿瘤液体活检产品，而从发布的指导原则中，从公开的审评报告中，企业也能够了解到审评的关注点，更加明确了企业的注册方向。作为企业人员我们也体会到了监管部门的改革力度，审评要求的公开、咨询交流机会的增多、审批的灵活性等都将助力创新产品的上市，逐步实现监管和产业的双赢。 随着肿瘤NGS伴随诊断产品的上市，未来仍有诸多问题需要监管和企业人员共同去思考，毕竟NGS产品的优势在于其对未知突变的发现，获得患者全景肿瘤突变图谱才能协助医疗人员更好的找到适合肿瘤患者的个体化用药。而近几年NCCN指南的每月更新，也印证了NGS在肿瘤研究与治疗中的突出贡献。如何发挥NGS产品的优势，如何在临床拓展其应用又能保证其安全有效性对监管策略提出了严峻考验。FDA的经验是否可以借鉴？基因大panel试剂盒申报是否会成为必然趋势？我们将拭目以待。我们相信，NGS相关产品的丰富，将使得患者有更多选择获知罹患疾病的复杂性、治疗方案和预后，会为提高患者的治疗效果和生存质量提供更优质的服务。
（责任编辑：dawenwu）