解析丨(2019-nCoV)核酸检测结果假阳性假阴性的原因

新型冠状病毒疫情的爆发成为当下国人关注的焦点。值得庆幸的是，从新型冠状病毒感染第一例治愈患者出院、2月1日治愈患者首超死亡患者这类消息的发布也为公众带来了战胜疫情的希望与信心但新型冠状病毒感染病例如何确诊以及治愈标准一直是医学界及公众最为关注的问题之一。目前，有不少媒体相继报道，核酸检测结果连续2次为阴性（隔日检测）即可判定治愈。但是，近日武汉大学中南医院医生张笑春却在朋友圈中不断呼吁，推荐CT影像作为新型肺炎的主要诊断依据，希望不要太信任核酸检测。此外，1__2月4日2月4日，美国安德森癌症中心肺科专家、终身教授张玉蛟发布文章表示，建议尽快建立CT做为新型肺炎的确诊标准，提高新冠病毒检测率。2__2月5日央视主持人白岩松在《新闻1+1》节目中，连线中国工程院副院长、呼吸与危重症医学专家王辰，介绍武汉疫情防控的最新进展。王辰表示，目前的检测方式主要还是对于病毒核酸的检测。但新冠病毒有一个特点，并不是所有感染的患者都能测出核酸阳性的！因此，有大量的看着流行病学史上、接触史上像是，临床症状上也像是，但是核酸未能得到确诊的患者，现在被列为疑诊病例。王辰建议，在疫情非常突出和严峻的武汉地区，对于有流行病史，有典型的临床症状的患者，应当可以列为临床诊断病例。因为核酸检测即便是对确诊病人，也不过只有30~50%的阳性率；也就是说，通过咽拭子这种检测方式还是有很多假阴性的患者，即核酸没有发现，却是确诊病例的患者。3__2月5日《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》发布，将“疑似病例具有肺炎影像学特征者”作为湖北省临床诊断病例标准，提示湖北地区新型冠状病毒诊断不再依赖核酸检测结果。这一诊断标准的改变，目前仅针对湖北地区疫情特殊情况，对于2019-nCoV的检查，《新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的肺炎诊疗快速建议指南(标准版)》强烈推荐对于疑似患者进行CT检查，以此结合核酸检测进一步确诊。因此有网友质疑，核酸检测这一技术在公共安全领域应用的可靠性。为大家梳理一下目前2019-新型冠状病毒核酸检测结果假阳性、假阴性的原因（仅代表一家之言，如有异议，欢迎大家在留言区共同探讨！）下面小编来具体分析一下原因_1、标本采集问题_高质量的标本，才可能有高质量的检验报告标本采集采样时机问题：鼻拭子/咽拭子标本：患者发病3日内，可采集鼻拭子/咽拭子标本；粪便标本：如患者发病早期出现腹泻症状，则留取粪便标本。标本质量问题（如采样部位、采样量）标本存放时间过长（病毒核酸降解），使用不合适的保护剂等都会造成假阴性。研究显示少数患者的感染部位仅限下呼吸道，而不在鼻咽部，所以咽拭子反复检测都是阴性，而CT显示症状不断加重的情况是存在的，建议取下呼吸道的肺泡灌洗液用来做冠状病毒核酸检测。咽拭子采集样本直接影响病毒采集量。样本采集方法不当，有可能造成无法采集到足够数量的口、咽部细胞，从而采集不到足够的病毒，导至病毒核酸拷贝数低，因此可能出现检测结果呈阴性。保存液问题，RNA保存液导至病毒颗粒沉淀，回收率降低。或保存液盐分高，导至裂解液无法有效释放病毒核酸。_2、试剂盒问题纯化问题：影响核酸提取纯化的因素包括裂解效率，中和沉淀，结合效率，洗脱效率等。同时，洗脱产物若含太高的盐份或乙醇也会对后续的PCR反应产生抑制作用。（注1：免疫细胞含有大量RNase 或使用的耗材、缓冲液含有环境中的RNase，裂解液不能完全灭活RNase，导至RNase污染。注2：冠状病毒是单链RNA病毒，在高浓度GuHCl或GuSCN中容易降解，不宜暴露时间过长。）逆转录酶：与Taq酶相比，逆转录酶相对脆弱，活性保持或获得高活性的逆转录酶相对不容易。纯化制品中RNase污染也是要充分考虑的因素。引物探针设计局限性，病毒变异位点在设计位点上。阳性对照品：需要注意的是，新型冠状病毒是RNA病毒，由于RNA的制备困难，很多公司的阳性参考品就用构建的质粒DNA或者PCR扩增产物来替代，但是DNA不参与提取和逆转录的过程控制，所以不能起到严格意义上的阳性对照。目前已见报道有公司申报注册的试剂中，阳性对照品为包含Orf1ab基因、N基因、内标基因扩增序列的假病毒，可以模拟样本中病毒核酸的原始状态，能够准确监控提取、逆转录、荧光定量检测全流程。还需要考虑到各个环节在核酸检测中都能起到质控的作用，对于新型冠状病毒来说，质粒DNA或PCR扩增产物的质控效果，只能在PCR扩增阶段起作用，所以假病毒颗粒的作用非常重要。_3、实验室_核酸提取过程要求精细操作，对操作人员技术有较高要求。如果操作不当，可能导至病毒核酸降解，最终导至检测结果呈阴性。新冠病毒为单链RNA病毒，相对于DNA，RNA极易降解。细胞内源性RNA酶或者实验室空间气溶胶里所携带的RNA酶都可能导至降解。室内质控分为阳性质控和阴性质控。目前，定点检测医院可以利用阳性病人标本灭活后，或者利用提取的核酸标本制备批量的内部质控品，有的实验室已经有制备了。而阴性质控可以使用试剂空白和非新型冠状病毒感染病人的样本等。 冠状病毒核酸检测室间质评工作，这个目前还没有开展，但这个非常重要。上海临床检验中心积极推进本项工作，目前还没有参加的实验室，应该尽快参加。报告解读与临床沟通 ：实验室进行核酸检验检测的结果，要主动与临床医生沟通，实验室结果要结合病史（是否到过武汉、是否接触过武汉发热患者等）、影像学表现，综合分析；临床医生会结合患者的临床症状、影像学、核酸检测等结果进行判断。当出现假阳性或假阴性结果，要寻找原因，并不断改进。总结：如下表：实验室对什么样的试剂盒相对满意？目前由于疫情紧张，很多厂家的试剂一研发出来就投入市场，没有做足够的性能验证实验，的确存在参差不齐的情况。在实际工作中，由于没有一个行业标准去评价新型冠状病毒核酸检测试剂的质量，我们只能通过不断地比对不同试剂盒，才能找到自己相对满意的一款，尽量地避免出现假阳性或假阴性。
（责任编辑：xsq）