诊断技术｜诊断用抗体的人工多样性引入及轻重链设计

这是一个技术专栏，在这个专栏当中，由全球诊断技术大咖为大家带来诊断技术开发方面的技术谈谈，这是本系列的第十五篇，我们非常有幸邀请到了Dublin City University的Stephen Hearty博士为大家讲解设计诊断试剂用抗体时，需考虑的因素。4.1多样性的人工引入在指定的CDR区域内引入多样性的最简单和最普遍应用的通用策略是利用氨基酸密码中的密码子退化。例如，通过使用NNS密码子（其中N=A、G、C或T S=G或C），我们有效地分配了32个密码子的冗余，以解决离散位置的20个氨基酸的完整范围。在实践中，NNK（K = G或T）常常被优先使用，因为其固有的GC覆盖率较低，可能会影响下游的测序工作。与最宽松的NNN密码子不同，NNK和NNS密码子只编码一个琥珀色（TAG）终止密码子。那么直观地说，希望随机化的序列空间越大，库的大小就必须越大。这就是关键的限制之一。例如，如果我们以9个残基的CDR为目标，用NNK退化法对其进行“硬随机”，那么就有可能出现209个（即5.1×1011）离散的氨基酸组合。这样的数字超出了目前细菌中可实现的最大转化效率。即使转化效率经常达到109~1010的范围，库的质量也可能因不同的密码子冗余、虚假的琥珀（TAG）终止密码子、任意的半胱氨酸和其他不利的组合而受到影响，这将减少整体表达，尤其是功能表达。因此，设计的饱和序列多样性和可获得的功能多样性之间存在巨大差异的可能性会对整体输出质量造成损害。出于这个原因，通常包括至少一定程度的“软随机化”，通常以CDR中的表位特征或惯性残基的知识为前提，这些知识可以在一个完全不那么投机的退化中得到充分的考虑。这可能需要将特定位置的多样性限制在一小部分疏水残基上，如F、I、L和V，可以用NTT密码子来编码。盒式诱变（图3）是最简单和最常用的合成库和诱变策略之一。图3|盒式诱变。这只是一系列连续的PCR。第一个PCR（引物1a或1b+1rev）将合成的多样性纳入CDR3。这种多样性可以被设计成更多（1a）或更少（1b）的饱和度，星号“*”表示目标诱变位点。第二个PCR（引物2+2rev）扩增包括CDR1和CDR2区域的N端区域，并包含2rev上编码的1a/1b重叠的序列。然后，两个PCR产物被纯化并在标准的SOE重叠PCR中结合。这第三个也是最后一个PCR步骤，得到完整的诱变库，并准备好克隆到感兴趣的载体上。His = 组氨酸标签（噬菌体和表达载体的共同特征，可通过固定化金属亲和层析法（IMAC）进行纯化。TOC = “选择的标签”，这是一个额外的标签，通常作为检测基团加入（如FLAG或HA肽序列）。三聚体寡核苷酸合成可以更精确地控制位置性密码子的分配，因此，可以更好地考虑密码子的使用偏差，消除假的终止密码子和序列重复。在未来，三聚体寡核苷酸技术可能会变得更有效、更实惠和更容易获得，就像加长寡核苷酸和化学基因合成几乎取代了传统的基因组或cDNA的PCR克隆。HuCAL文库的演变证明了在使用密码子控制的文库构建方法时，文库可以变得多么精致。Morposys公司对Slonomics技术的收购无疑将进一步加强密码子控制的文库设计，因为使用合成的双链三联体序列的“sloning”方法非常精确地消除了虚假的终止密码子、序列重复、不加选择的半胱氨酸、N-连接的糖基化位点和其他不稳定的动机的风险，也是已知的提高文库能力的方法。4.2用体外亲和力成熟的方法引入多样性体外亲和力成熟可以通过随机或定向突变策略来实现，使用的基本原则与在合成CDR库中引入多样性相同，但程度较低。通过使用易错PCR（EP-PCR）可以进一步增加突变负荷，尽管有时这可能会在位于CDR定义的主要准基之外的关键贡献残基上引入突变。这可能会引起医生的反感，但只要表达和稳定性不受影响，这种突变体的后代在诊断应用中一般是可以接受的。轻链洗牌通常被看作是微调克隆亲和力的保守手段。通常这种策略是成功的，可以得到更好的亲和力的克隆，但是，特别是在免疫库的情况下，可以说如果原始库（取决于它的大小和多样性）被更全面或更严格地询问，那么同样高亲和力的克隆可能被分离出来。在某些情况下，高亲和力的克隆可能是由于对洗牌库施加了更严格的选择条件。即使有最优化的文库，任何抗体分离活动的成功，尤其是从重组和合成文库中分离出来的，都是一个简单的数字游戏。人们早就认识到，可获得的克隆多样性和返回的抗原结合克隆的亲和力之间有明显的相关性。这不仅仅是重组抗体库的一个限制，事实上，自然剧目的理论累积（序列+组合）多样性太大，无法在现有的B淋巴细胞库中容纳。这就是为什么天然体内剧目必须被认为是一个动态剧目，无情地耗尽、丰富和集中免疫B细胞库存，以提供必要的免疫力。从这个纯粹的算术解释中可以看出，无论采用天然还是合成库，主要的限制实际上是对现有的多样性进行分割和处理。与体内免疫相比，在体外，我们有能力使用合理和严格的选择技术来偏重或集中库的内容。重要的是，我们不受体内BCR进化中普遍存在的动力学结合限制，因此，理论上有可能从免疫组合库中分离出非常高亲和力的结合物。实际上，唯一的限制因素是如何实际分割和取样这样大的多样性。5、挑战惯例免疫学惯例认为，H链，特别是CDRH3结构域是体液序列多样性的主要焦点，因此也是决定副体功能的事实上的主要因素。在天然和重组的抗体中出现的大量轻链杂交的例子证实了这一点。因此，该教条将L链和从属的H链CDRs（CDRH1和CDRH2）归为体液免疫舞台上的辅助性“小角色”。这些从属元素不是决定特异性，而是发挥辅助作用，表面上有助于微调亲和力。因此，通常的做法是对需要增强亲和力的候选抗体进行轻链和从属CDR的洗牌。事实上，我们的存在是建立在这一惯例的“充分性”之上的。然而，在完善合成抗体库设计方面取得的巨大进步已经开始挑战这一惯例。这样的库可以克服体液系统的多样性创造能力对CDRL3的限制，当足够的多样性被赋予CDL3时，它确实可以承担主导作用，并决定了旁观者的功能。直到最近，带有较长CDR3环（>14~16个残基）的抗体被认为是免疫学上的异常现象，它们在骨髓中逃避了选择，并持续增强和加剧了自身免疫事件，如类风湿性关节炎（RA）。针对HIV的广义中和抗体（bnAbs）（VH3-23和Vk1-33*01）是这一规则的明显例外，迫使我们将延长CDR环的长度视为免疫学曲目的合法和有利的组成部分。似乎有理由推测，这种明显不协调的抗体类对病毒中和是有利的，因为它们可以进入缝隙或由于膜接近、结构域折叠或糖类屏蔽而部分闭塞的区域，而且随着抗原足迹的减少，产生逃逸突变体的可能性也会随之减少。考虑到一个人在戴着拳击手套试图在键盘上打字时可能遇到的困难，就很容易理解这种旁观者的灵巧性。越来越多的人相信由种系编码的抗体所介导的另一种自然体液免疫。这些抗体尽管没有经过任何体内体细胞的成熟过程，但仍具有免疫活性。迄今为止，这种所谓的SOS抗体反应的最有力的证据基础是关于3个强大的流感中和抗体的迷人案例，每个抗体都来自同一个VH1-69种系基因，分别从三个不同大陆的病人那里分离出来。这符合这样的观点，即全部的免疫复合物都能很好地适应其配体的作用，以至于可以根据在更广泛的抗原范围内对同族抗原的更明显的亲和力的表现，来合理地描述定义的离散的抗体特异性。这种SOS成分是必要的，特别是在病毒感染的情况下，生存依赖于即时的反应，精心设计的产生多样性的体液机制的杂音被有效地去掉了，在一个真正的“适者生存”的例子中变得多余了。据推测，这个抗体子集的功能是凭借拥有特别疏水性的CDRH2环。严格的基于亲和力的选择不太可能产生这样的抗体共识。幸运的是，对于大多数的诊断应用来说，特异性、亲和力和稳定性才是我们努力追求的重要指标。
（责任编辑：dawenwu）