非小细胞肺癌生物标志物检测方法在欧洲的发展趋势

检验视界A-A+所有不可手术治疗的NSCLC患者都需要尽快筛查生物标志物（5~10天内出结果），以选择一线靶向治疗、免疫治疗或免疫治疗+化疗组合。编译：王轲校审：赵晓涛单位：北京大学人民医院检验科内容提要癌症驱动基因突变的发现带来以小分子抑制剂为主的靶向和免疫治疗的发展，并引领了非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）治疗方法的革新。如今，所有符合治疗标准的晚期NSCLC患者（以及数量呈增长趋势的早期患者）需要快速、全面地生物标志物筛查，以选择靶向治疗、化疗或免疫治疗的组合方案，而不是非选择性的化疗方案。为了避免重新进行活体检查，一线治疗前进行的生物标志物检查应包括二线治疗需要的标志物；PD-L1表达检测也应在开始治疗前进行。癌症驱动基因的突变频率存在人群差异：EGFR基因突变在亚洲更常见，在欧洲则是KRAS基因突变。除了已批准的一线治疗方法外，一些新兴的治疗方法正在接受临床试验研究。世界各国对肺癌生物标志物检测的指导原则各不相同。但从总体趋势来看，待检的靶点数量预计会增加，分子筛查策略也更加广泛。为了满足诊断需求，目前已普及了单驱动基因突变的快速筛查技术。以DNA和RNA为基础的下一代测序技术（next-generation sequencing, NGS）的发展使得人们能够在一次检测中对一组基因进行分析；然而，周转时间（turnaround times, TAT）仍然相对较长。因此，建议在实施下一代测序技术的同时进行快速筛查技术。在NSCLC生物标志物检测的发展格局中，下一步挑战是探明靶向治疗原发性和继发性耐药机制。为此应在癌症发生进展时的再次活检中进行更加全面的基因检测，并可结合循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA, ctDNA)检测，为指导二线或三线治疗提供重要信息。此外，对肿瘤生物标志物检测的纵向研究可以深入了解疾病过程中肿瘤的演变和异质性。我们总结了欧洲在诊断和治疗过程中生物标志物检测的最佳实践策略。目前肺癌仍然是全球癌症死亡的主要原因。2018年，欧洲大约有38.8万例肺癌相关死亡，这一数字高于结直肠癌和乳腺癌相关死亡数的总和。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占所有肺癌病例的84%，给全欧洲带来了巨大的社会和经济负担。根据精准医疗的原则，非小细胞肺癌的治疗格局正在迅速转变以生物标志物为驱动的靶向疗法和与之对应的分子诊断方法。“精准医疗”是指对于有某些分子或形态学表型特征的癌症亚型，针对性地对这类患者使用更有可能使其受益的治疗方法。目前研究表明NSCLC与多种癌症驱动基因的突变有关，如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS（ROS proto-oncogene 1, ROS1）、B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene, BRAF）和神经营养性酪氨酸激酶受体（neurotrophic tyrosine receptor kinase, NTRK）等，并与选择最优治疗方案相关。新的NSCLC生物标志物也不断出现，包括转染时发生重排（rearranged during transfection, RET）、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor, MET）外显子14(exon 14, ex14)跳过突变和MET融合基因、ERB-B2受体酪氨酸激酶2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2, ERBB2/HER2）、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS）外显子2 G12C、神经调节蛋白1（neuregulin, NRG1）、成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor , FGFR）融合和点突变，以及EGFR外显子20插入。此外，程序性死亡受体-配体1（programmed death receptor ligand 1, PD-L1）和肿瘤突变负荷（tumour mutational burden, TMB）的检测可以预测肿瘤对免疫疗法的适用性。已批准的和新兴的治疗方案数量不断增长，加上分子生物学检测技术的快速发展，NSCLC的治疗格局正在发生快速变化。这给生物标志物检测指南的制定和实施带来了挑战。目前生物标志物检测是实现NSCLC精准医疗的基础，但检测效果仍不理想。在文中，我们概述了欧洲NSCLC的诊断和治疗格局：过去十年里，NSCLC的驱动基因呈增长趋势。我们全面概述了当前欧洲已应用的和正在研究的NSCLC生物标志物，包括检测技术和最新研究进展，以及当前建议的生物标志物检测实践指南。我们还讨论了新的进展和对未来发展的影响。一、当前和最新的NSCLC生物标志物概览NSCLC的体细胞突变可通过几种机制导致致癌性激活，包括点突变、插入/缺失和重排。一般来说，指导靶向治疗的突变通常根据突变机制对分类，例如基因重排（ALK、ROS1、RET、NTRK、EGFR1/2/3、NRG1）、点突变、插入/缺失和基因扩增（如EGFR、BRAF、丝裂原活化蛋白激酶[mitogen-activated protein kinase kinase , MEK]、KRAS、MET、ERBB2/HER2）。本文中使用“靶向治疗”来表示针对敏感基因突变的治疗方法，用“免疫治疗”表示针对免疫检查点蛋白（程序性死亡1/程序性死亡配体1[programmed cell death protein 1/programmed cell death ligand 1, PD-L1]或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4[cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4]）的治疗方法。TMB（肿瘤基因组每个编码区的非同义突变数量）被证明可以预测免疫疗法的客观反应率和无进展生存期的改善。总体来说，与没有敏感基因突变的患者相比，具有敏感基因突变的患者在接受靶向治疗的预后往往得到更好的改善。因此，检测这些“靶点”的分子检测在NSCLC患者的诊疗过程中起着指导治疗方案选择和影响患者预后的关键作用。表1提供了欧洲NSCLC当前和新出现的生物标志物、它们人群频率和相关机构批准的靶向治疗的概况。二、NSCLC生物标志物检测指南1.国际指南： NSCLC在不同人群中癌症驱动基因的突变率可能不同，例如亚洲人群的EGFR突变率高于欧洲人群，而KRAS的突变率低于欧洲人群。因此，不同指南中驱动基因可能根据所在的地区有不同的优先级。欧洲肿瘤内科学会（European Society for Medical Oncology, ESMO）发表的NSCLC临床诊疗指南指出，分子亚型对于临床治疗决策是必要的，无论何时都应尽可能地进行检测。对于晚期NSCLC患者，ESMO建议检测EGFR和BRAF突变，分析ALK、ROS1和NTRK基因重排，并检测PD-L1的表达。ESMO还建议在晚期非鳞癌患者中常规使用下一代测序（next-generation sequencing , NGS）技术，并且多个基因组合的panel基因组和仅含少数几个基因组合的panel相比，其额外增加的成本通常可以接受。一般来说，目前，国际共识是晚期NSCLC患者应检测EGFR、BRAF、ALK和ROS1基因，并且在欧洲各国指南都对这些基因靶点批准作为一线治疗方案（图1A）。ESMO、美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network , NCCN）和泛亚洲（Pan-Asia）NSCLC指南推荐进行PD-L1检测，同时NCCN额外推荐增添对NTRK的检测；这两种生物标志物在欧洲都有已获批准的治疗方法。对于新兴的生物标志物KRAS、MET、RET和ERRB2/HER2突变，目前仅有NCCN、美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology , ASCO）和美国病理家学会（College of American Pathologists, CAP）/国际肺癌研究协会（International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC）/分子病理学协会（Association for Molecular Pathology, AMP）的指南中建议纳入检测（图1B）。2.国家指南： 国际诊疗指南通常是区域性或各国诊疗指南的基础，欧洲大多数病理学家和肿瘤学家主要参考ESMO和NCCN指南。各国的诊疗指南需根据当地的医疗模式和资源进行调整，反映各个国家的最佳实践方案。因此欧洲各国的检测策略各不相同（图2）。所有国家的诊疗指南都推荐检测EGFR、ALK、ROS1和PD-L1，大多数国家推荐检测BRAF和NTRK。荷兰和瑞典推荐检测KRAS、MET、RET和ERRB2/HER2等新兴生物标志物。一般诊断策略是，先使用快速检测技术（如单基因检测/多重基因检测、免疫组化、荧光原位杂交[fluorescence in situ hybridization, FISH]）对常见的生物标志物检测之后，使用NGS进行额外的分子检测，并可以根据临床指定要求或出于研究或试验的目的进行。大多数欧洲国家指南中没有对TMB进行常规评估。NSCLC的另一项挑战是为了应对越来越多的靶向药物，需要分子检测技术快速变化以跟上步伐。然而制定新的诊疗指南和达成专家共识需要时间，导致临床实践工作滞后与科学发展进步。与那些只对生物标志物名单目录上的基因进行单基因检测的国家相比，推荐采用NGS方法并将其纳入医保体系的国家会更容易在检测方案中增添新的基因。有部分国家的诊治指南推荐纳入检测大量生物标志物，但这不一定能在日常临床实践中应用，尤其是受到报销方面的挑战。三、NSCLC分子标志物检测的挑战1.欧洲分子生物标志物检测的进展现状： 在整个欧洲，分子生物标志物检测技术的覆盖率有很大差异。例如在德国、意大利和西班牙，晚期非鳞状NSCLC患者接受分子检测的比例在65%~85%之间（2011-2016年），EGFR的检测率从最低的中欧/东欧国家的65%（2014年）到检测率最高的瑞士的79%（2014年）不等。随着时代发展，分子检测的覆盖率不断增加：瑞士的一项观察性研究表明，EGFR的检测率从2009年的32%增加到2014年的79%。同样，在五个国家（法国/德国/意大利/西班牙/英国）的研究发现EGFR检测率在2014-2017年期间从71%增加到81%，KRAS检测率从38%上升到59%。在瑞典，晚期非鳞状NSCLC患者的EGFR检测率从2011-2012年的49%增加到2019年的84%，由于在全国范围内推广NGS检测技术，包括KRAS在内的新靶点的检测率可能与之相近。对于一些欧洲国家诊疗指南推荐的较新的预测性生物标志物（如BRAF和NTRK），检测率一般低于较成熟的预测性标志物（如EGFR、ALK和ROS1）。例如在德国，2015年至2019年间，BRAF的检测率为53%，而EGFR、ALK和ROS1的检测率分别为72.5%、74.5%和66.1%。最新的ESMO指南中增加了对NTRK基因检测的推荐，可见欧洲国家的生物标志物环境仍在快速发展。然而不可避免的是，临床实践中往往跟进会延迟。2.医疗资源和机构的障碍： 在有限资源的医疗环境中，肿瘤科和胸外科医生必须决定用何种方法为肺癌患者检测哪些生物标志物。考虑到行政方面的因素，比如监管部门对新药的审批、对检测试剂和方法适用范围的审批（尤其是新兴生物标志物）和报销/医疗保险范围，使得临床决策变得复杂。在欧洲，能否报销是决定药物应用和检测可行性的关键因素，在靶向疗法和分子检测的可行性方面，西欧和东欧/中欧之间存在差异。报销的限制性被认为是阻碍中欧/东欧分子检测应用的一个重要障碍，不利于按病人需要进行检测。液体活检和组织活检两种检测方法在报销上的国别差异又增加了一层复杂性。此外，如英国部分公立卫生服务机构，不支持检测仍在临床试验阶段的一部分靶点。某些人群频率较低的生物标志物（如NTRK融合基因）给检测策略带来特殊的挑战。传统的筛查策略通常能降低成本，如先通过免疫组化技术进行筛选，再对阳性标本进行测序。然而鉴于晚期NSCLC患者的肿瘤组织标本数量往往有限，NGS可同时对多个基因测序的优势被证明有其优势。事实上，对于同时检测四个以上的目标基因，NGS通常比单基因检测更具有成本优势。此外，这种策略可能有助于增加晚期NSCLC患者获益的生命年。美国的一个模型比较了NGS检测策略（包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、MET和NTRK）与单基因检测策略（EGFR和ALK）在NSCLC中的价值：如果NGS策略比单基因检测策略增加10%，结果能多获得2630个生命年，每一生命年可节约49~109美元。（1）临床实践中的挑战（周转时间、检测复杂性和反馈实验）：临床周转时间（TAT）被认为是推广分子检测的一个重要障碍：考虑到疾病发展的潜在风险，肿瘤科/胸外科医生和患者可能不愿意等待检测结果而推迟治疗。为了最大限度地减少TAT，分子检测最好与病理学诊断在同一个医疗机构进行，并采用标准操作程序（SOPs）。但这也取决于当地服务机构的医疗水平，只有在足够多患者标本的地区才有可能配置相应仪器设备，并对专业人员进行培训。测序技术的复杂性可能会影响影响地区可行性。ASCO/CAP/IASLC/AMP指南建议从收到标本到报告分子检测结果之间的TAT位10个工作日；最近欧洲专家组建议分子检测的实验周期为5个工作日。TAT的延迟可能导致靶向治疗的效果大打折扣，例如在受到突变检测结果之前启动免疫治疗可能令EGFR酪氨酸激酶抑制剂被用作二线药物而非一线。反馈实验（reflex testing），即在组织学诊断为晚期非鳞状NSCLC后，立即由病理科医生开具分子检测单，这与由主治医生开具检测相比可以缩短治疗开始的时间。反馈检测对于像NSCLC这样需要检测分子标志物以及时对治疗方案开展决策的侵袭性肿瘤非常重要。反馈实验有利于充分利用肿瘤组织标本（如果同时对标本分析所有相关的生物标志物还能节约标本），并提高分子检测的覆盖率。然而，这一筛查策略受限于临床管理的复杂性，病理科可能无法获得足够的临床信息来指导其诊断。CAP/IASLC/AMP建议，如果检测策略中病理科与治疗团队直接沟通并公开顺畅，病理科医生主导的反馈检测策略便是合理的。如果反馈检测应用不当则可能会增加不必要的成本，并且可能受到报销方面的限制（例如需要主治医生推荐）。采用NGS进行反馈检测可以覆盖更广泛的生物标志物，但可能需要更长的TAT，目前即使在理想情况下也很难达到10个工作日。另一种解决方案是两阶段的策略：PCR对单个基因的关键突变靶点进行快速检测，然后是更广泛的NGS方案。但这种策略的标本利用率较低，并且成本较高。（2）生物标志物检测的分散式与中心式：在医疗机构缺少相应设施的情况下，欧洲的许多病理科将分子检测工作外包给独立的第三方实验室或公立医疗系统内的地区检验中心。集中标本检测可以提高效率，并通过SOP实现标准化。然而与院内实现分子检测相比，外包的分子检测会带来额外的物流时间成本，对TAT产生负面影响。此外，不同临床机构的分析前因素有所不同，这可能会影响集中检测效果。虽然中心实验室一般能满足指南中TAT的要求，但从检测申请到标本送样之间也会产生延误；另外，如果中心实验室在标本批量检测中制定标本最低数量的要求，可能会导致标本数量少的地区出现延误。欧洲各地使用外包分子检测实验室的情况差别很大。例如，意大利等一些国家仍然主要在医院内部进行分子生物标志物检测。其他如捷克共和国则采用混合的方法，建立一个由十个较大实验室组成的全国分子检测网络。小的医疗机构对检测进行外包，大的医疗机构则在内部进行检测。最后，如德国、瑞典、荷兰和英国已经建立了集中的国家分子生物标志物检测网络，以提高检测的覆盖率。随着NGS技术的应用越来越普及，预计未来分子检测有更加集中的趋势，以简化标本的高通量分析和数据管理。总体来说，集中化的高通量分析可以提高检测治疗，能够提高检测效率并降低成本。（3）组织活检的限制：历史上，NSCLC分子检测的另一个关键障碍是活检标本中肿瘤组织的数量。标本采集和管理的提高意味着肿瘤组织的可获得性不再是一项限制因素。对小活检的主动管理可能会增多分子检测机会。早期的NGS技术需要使用较多的标本，但随着技术的改进和分子检测靶点数量的增长使得天平偏向于NGS而不是单项检测。为了达到最佳的分子检测效果、标本取样方式最好能考虑到任何导致肿瘤内异质性（肿瘤内的基因组/生物学变异）和肿瘤间异质性（来自同一原发肿瘤的多个小原发肿瘤或转移性结节的基因组/生物学变异）的克隆进化，尽管这一点还未能实现。肿瘤内部和肿瘤间的异质性被认为是导致治疗无效和耐药的关键因素，针对耐药机制的治疗策略是未来改善临床预后的重要因素。液体活检能实现肿瘤基因组的连续取样，越来越多地用于检测肿瘤的克隆进化，有助于识别肿瘤中产生可操作性突变以指导二线治疗手段。（4）技术考虑因素：诊断的灵敏度、测试运行时间、不同供应商提供的检测方法学性能上的差异，以及对商业试剂盒亦或实验室自己开发试剂盒的偏好，都会影响到实验的选择。表2总结了现有分子检测技术的检测能力、敏感度和TAT。更进一步的考虑因素是在肿瘤细胞比例低于推荐阈值的标本中，有必要进行肿瘤细胞富集以提取DNA。不同技术之间的cut-off值/评分系统也会有所不同，特别是对于没有商业测试的新兴生物标志物。（5）报告和解释：准确报告生物标志物检测结果是至关重要的，报告应及时完成，并能一眼得知生物标志物的状态以便将来使用。欧洲标准化委员会已经为医学实验室制定了关键的报告标准，以减少不清楚的地方（ISO 15189）；表3对这些进行了总结，并对报告结果增添了一些额外的考虑因素。关于典型临床报告格式的指导意见在前文介绍。随着NGS应用的增加，肿瘤科/胸外科医生需要接受适当的培训以解释临床治疗的结果。最近的一项研究表明，肿瘤科医生对使用单基因检测的结果最有信心，而对使用全基因组或全外显子测序的结果指导患者治疗方案最没有信心。在调整后的模型中，基因组学方面的培训可以令医生对检测结果有更高的信心。开发一个真实世界知识数据库可以帮助解决临床医生难以解释测试结果的问题。（6）分子标志物突变的分类：为了在临床实践中引入新的生物标志物来促进精准医疗实践，必须对基因组学数据的报告和解释进行标准化。有一些工作团队提出了分类的方案，以对生物标志物的突变进行临床效用分配，并以此选择靶向疗法。ESMO分子靶点临床可操作性量表（ESMO Scale of Clinical Actionability of molecular Targets, ESCAT）提供了证据的评价标准，以确定标志物的优先级，并为患者选择合适的靶向治疗方案。ESCAT根据靶点对患者管理的影响，定义了6个级表的临床证据，从I级（可用于常规临床决策）到X级（缺乏可操作性证据）。AMP/ASCO/CAP指南根据体细胞突变在癌症诊断、预后和/或治疗中的临床意义，将体细胞突变分为四个等级，提供了基于证据的分类依据。精准肿瘤学知识库（Precision Oncology Knowledge Base, OncoKB）定义了四个级别的证据，以支持在某一型突变的适应症中选择对应药物。最后，德国的MURIEL数据库也不断更新，以提供关于基因组可操作性突变的统一临床建议。虽然生物标志物分类框架在理论上有可取之处，但也存在其局限性。大量新出现的证据，特别是来自NGS检测的证据可能会使分数迅速变化，而且往往难以评估新发突变的相关性。此外，新型生物标志物的证据基础在不同的适应症中有所不同。例如，KRAS（和NRAS）突变在NSCLC中具有潜在的预测预后作用，KRAS G12C  抑制剂显示出治疗前景。目前正在携带KRAS G12C 的患者中进行临床实验研究。另一方面，在转移性结直肠癌中，KRAS突变已经成为抗EGFR抗体的阴性预测因子。因此，每一个生物标志物不能被简单赋予一个重要性权重，必须结合癌症类型进行评估。最后，随着测序技术的广泛应用，临床医生将不得不解释在原肿瘤克隆中发现的癌症驱动基因突变和可能由于耐药机制产生的亚克隆突变。对亚克隆突变的临床相关性解释是有挑战性的，但它们对指导二线治疗方法的选择是重要的。在实践中，ESCAT可能更适用于分子肿瘤委员会（molecular tumour board, MTB）的应用背景，或在报销目录的选择中辅助政策制定者。在更普遍的层面上，许多分子生物学实验室会采纳CAP/IASLC/AMP指南的建议，通过不同的方法学实验来确认NGS的检测结果，例如通过使用免疫组化的原理对融合基因的检测结果进行验证。四、NSCLC生物标志物检测的最佳实践1. 多学科管理模式： 肿瘤治疗团队对于实现患者最佳诊断和最优治疗非常重要。多学科交叉的方法可以提供更全面的诊断分型并更优地贴合治疗指南，从而提高患者的生存期。例如，由临床医生、分子病理学家、临床分子生物学家、遗传学家和生物信息学家组成的MTB可以改善应用遗传学指导的癌症治疗方案。在40%的肺癌病例中，MTBs被正式可以影响提供的最初治疗方案。多学科管理还有助于反馈测试，但这种方法可能仅限于具有内部分子实验室的医疗机构；如果将分子检测外包出去，多学科管理的实施则更具有挑战性。2. 组织活检或液体活检的考虑： 多学科方法对于获取适当的诊断用标本是至关重要的，标本可以由不同专业人员的多种方法获得。通常需要对标志物的诊断、评估而在基线时采集标本，以及为了确定肿瘤对靶向治疗的耐药机制而在疾病进展时采集肿瘤标本。一般采集自肿瘤原发部位或易得的转移部位标本用于诊断。在选择合适的采集部位时，应维持对于患者而言最安全、最易得的部位和取得足够的标本量需求之间的平衡。欧洲专家组（European Expert Group, EEP）建议指出，应至少进行5次气管内超声/经气管镜活检，并可考虑增加5次活检次数或2次低温活检；建议每次气管内超声/经气管镜活检至少进行四次穿刺；至少有两次经皮粗针活检（18-20号针）或3-6次粗针穿刺活检。为了保证有足够的肿瘤细胞用于检测，上述建议次数最好当作最低限度。快速现场细胞学评估（Rapid on-site evaluation，ROSE）是一种可以快速评估组织活检取得标本是否合格的方法流程，它的使用有几个优点（图3），应将其作为NSCLC生物标志物检测工作流程的一部分。影像学引导经皮细针穿刺活检可在中间到周围病变时作为粗针活检的可靠替代方法，更容易收集细胞学标本，较少引起患者不适，在无法进行组织活检时在临床实践中常规使用。非小细胞肺癌的细胞学诊断通常基于气管内超声细针活检、支气管镜刷检、胸腔积液和远处转移部位经皮细针穿刺。可用于分子检测的标本类型包括先前染色固定或乙醇固定的图片、组织块和液体标本，一般要求标本中肿瘤细胞的质量较好、占四分之一以上。其中组织块的适用性最好，一般现有实验室的标准操作流程都可适用。最后，德国的S3指南建议再次活检时尽量采用液体活检的方法。如果标本量不足以完成分子检测，病理学家可以最大化地利用它。形态学分析足以确定肿瘤组织学结果，如果需要通过免疫组织化学进行亚型分类，大多数肿瘤也可以通过单一地腺癌标志物（如TTF-1）和单一地鳞癌标志物（如p40）进行分类。建议用组织块制备组织切片标本，这样可以保留组织原有结构，并可提供不同厚度部位的多个切片用于各种分析，包括形态学和核酸检测。病理学家应在玻片上标记最典型的区域以便于得到肿瘤信息，最好可以将其提取到另一张空白玻片上。显微切割可用于获取更高肿瘤/非肿瘤细胞比值的切片标本，并最好在分子级洁净区域下进行。这种“肿瘤富集”技术对于直接测序和NGS来说是必要的。对于反馈实验流程，应保留初次诊断时的切片，以避免在附加检测中需要从组织块中获取新切片。为了避免污染风险，只有在洁净环境下进行的反馈实验才能用于后续的核酸提取和分析。用于分离DNA的细胞学材料（如涂片）也可作为一种备用方法最大化地利用组织。组织活检仍然是NSCLC生物标志物检测的“金标准”。虽然液体活检在组织活检标本量不足时可以使用，但检测机构不应以不佳的组织活检/处理程序作为依赖血液检测的理由。如果患者存在活检的禁忌症（如出血风险），或处在一线治疗期间无法进行再活检，且需要检测二线治疗相关生物标志物时（如EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗发生疾病进展时对EGFR T790M 检测），液体活检将是好的替代方法。此外，随着严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-Cov-2）大流行对常规临床实践的影响，采用液体活检可以避免有风险的侵入性组织活检操作。IASLC建议在提取DNA（ctDNA）时采用血浆而不是血清，从抽血到提取血浆的最长时间不超过2小时（EDTA管）或3天（保存管），在血浆提取前不得冻存血液。所需的血液量取决于检测机构的SOP和待测面板的大小，不过许多欧洲实验室要求使用两支10毫升的标准采血管。目前欧洲批准的液体活检的靶向测序仅限于EGFR突变检测，包括cobas EGFR 突变检测v2试剂盒和Therascreen。新的基于NGS的辅助诊断方法即将在欧洲获批准（见6.3节），Guardant360 ® CDx和FoundationOne ® Liquid CDx已在2020年获得美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration, FDA）的批准。3.下一代测序技术： 在常规实践中采用NGS有助于从足够体积的肿瘤组织中综合地描述当前和新出现的可靶向治疗的基因组突变特征。NGS可以从肿瘤组织或ctDNA（液体活检）中对整个基因组或外显子组、转录RNA或从几个到几百个外显子组以及少量的内含子组进行测序。NGS不能测量蛋白质表达的生物标记物（如PD-L1）。单分子检测或小型集合核酸检测通常比NGS检测更快（因此缩短了总体TAT），并且单个分子检测的成本通常更低；然而，技术进步已经能够减少NGS的运行时间，并且可以节约总体检测的成本。考虑到目前欧洲批准的靶向驱动基因（EGFR、ALK、ROS1、NTRK、BRAF）突变数量较多，而且其他驱动基因突变也即将纳入指南推荐（KRAS、MET、RET、ERBB2/HER2、NRG1、FGFR1），在诊断时扩大NGS的检测面板（而不是8~12种独立的检测）是确定最佳治疗方案的最有效的方法，从而改善患者的治疗效果，同时可以避免不必要的再次活检。如前文所述，NGS与现有传统检测方法的结合使用策略仍在发展中。总体而言，在全欧洲使用NGS的局限性可能包括运行时间（正在改善）、一些国家治疗和检测费用纳入医疗保险情况不同（可能反映了每个国家的经济状况）、NGS结果的解释和验证以及大型数据库的管理。4.室间质量评估计划： 实验室必须建立可接受的质量控制程序和室内质控监测，并应参与室间质量评估计划（external quality assessment, EQA）。EQA对于实现各个实验室的准确性和标准化非常重要。此外，EQA计划对于比较生物标志物全球预测研究也很关键。EQA计划的指南已经出台。EQA的实施已被证明在临床上是有益的，并能改善结果报告。在欧洲，已建立了几个与NSCLC相关的EQA计划，最著名的是欧洲分子遗传学质量网络（European Molecular Genetics Quality Network, EMQN）和英国NEQAS免疫化学（ICC）和 in situ hybridization(ISH)。5.最佳实践建议的概要： 基于专家共识，图3总结了目前对于未经治疗的晚期NSCLC和已治疗的进展/复发NSCLC患者的诊断和管理的最佳实践建议。最佳实践要求在现有资源充分利用的情况下，将当前最新科学知识应用于临床实践。因此，生物标志物的最佳选择可能根据各国具体的检测方案和相应的靶向疗法的可用性而有所不同。五、欧洲NSCLC生物标志物检测的未来发展1.新出现的NSCLC靶向疗法： Selpercatinib和Pralsetinib分别在2020年5月和9月被FDA批准用于RET融合阳性的NSCLC患者；这两种药物在欧洲尚在审查中。Tepotinib和Capmatinib于2020年在日本获批用于METex14跳过突变的NSCLC患者；在2020年5月，FDA加速批准Capmatinib用于METex14跳过突变的NSCLC患者。在过去研究中，KRAS是人类癌症中最常见突变的致癌基因，也是调控细胞增殖和分化的关键分子，被认为是难以作为治疗靶点的。大多数肺腺癌中的KRAS突变被认为是肿瘤进化早期的克隆性致癌驱动基因，尽管亚克隆中KRAS突变可以发生但相当罕见。KRAS突变很少于其他可操作的致癌驱动基因突变（如EGFR、ALK、ROS-1）重叠，因此KRAS突变型NSCLC患者不能从针对这些突变位点的疗法中获益。大多数KRAS突变型NSCLC患者有吸烟的既往史，但仍约有5~10%的患者没有吸烟史或轻度吸烟，因此无论有无吸烟史，所有患者都应进行KRAS突变检测。在缺少KRAS靶向药物的情况下，KRAS突变型实体瘤患者的治疗方案选择有限。在欧洲，高达三分之一的NSCLC腺癌病例存在KRAS突变。KRAS G12C 最为常见，占KRAS突变的40~46%，占所有NSLCL腺癌病例的13%。然而KRAS的突变状态对预后的独立影响一直难以评估，因为它与吸烟史及伴随吸烟相关的共同突变（如TP53/STK11）混杂在一起。对KRAS的结构研究进展引起Sotorasib（AMG 510）的药物开发，这种小分子可以共价且不可逆地与KRAS G12C 突变蛋白的半胱氨酸结合，将其控制在非活性状态，从而阻止KRAS依赖性致癌信号的转导，而不影响野生型KRAS信号的转导，从而抑制癌细胞的增殖和存活。Sotorasib在1期临床的剂量递增部分被证实对NSCLC患者有抗肿瘤活性，并在CodeBreaK 100研究中注册进入2期临床研究。对于未转移的晚期和转移性NSCLC患者的2期和3期临床研究正在进行（NCT03600883，NCT04303780）。另一个针对KRASG12C 的靶向药物（Adagrasib, MRTX 849）在移性正在进行的1/2期临床试验中被证实对NSCLC患者表现出客观反应。其他的KRASG12C 抑制剂正在进行早期阶段的临床试验（如GDC-6036）或前临床实验。对NSCLC的其他几种靶向治疗方案正在进行临床评估，泛RAS/SOS突变抑制剂也处于临床开发的早期阶段（见表1）。总体来说，已公布的Sotorasib和Adagrasib的1期临床数据令人期待，表明等待已久的针对KRAS突变型NSCLC患者的靶向疗法可能即将出现。这些实验数据提示在一线治疗前应对KRASG12C 进入分子检测面板，以确定这部分可能受益于新兴KRAS靶向疗法的患者。2.技术发展： 目前正在评估的大量NSCLC靶向疗法强调了不断验证并修订分子检测策略的必要性。靶向基因数量的增加会给予NGS更多的成本效益。NSCLC的NGS面板增加将允许同时检测多个靶向基因，并最大限度地减少额外组织标本的需求。最终，NGS技术的应用取决于检测机构是否有可行的技术平台（如核酸联合检测能力和全自动平台），以及医疗保险支付和行政方面的因素。同时，液体活检的应用预计会增加。IASLC最近得出结论：“液体活检在改善病人护理方面有很大的潜力，并且在临床上立即应用于多数NSCLC相关的治疗环境是合理的。”然而考虑到液体活检明显较低的总体检测灵敏度，在不久的将来液体活检仍不太可能代替组织活检。更有可能的趋势是液体活检将以一种补充的方法在检测中应用，减轻标本相关的限制因素。如何更好地应用这种检测方法还有待观察研究。3.欧洲的立法变化： 在欧洲，相对于商业试剂盒而言，经认可的实验室自行开发的实验可能仍然更受青睐，但这取决于未来几年新的IVD医疗器械(2017/746)欧洲法规。如果以当前法规的形式实施，这将利于商业测试的应用推广，因为试剂制造商需要进行临床性能分析，并根据实验的风险等级证明其安全性和性能。虽然这是向标准化的方向迈进了一步，但也并非没有问题：目前，提供预测性检测的实验室必须获得认可，或至少参与一个实施中的质量管理体系（包括室内和室间质量评价）；另一方面，价格较高的CE-IVD试剂盒，以及试剂和现有检测平台升级的需要可能会增加成本，并限制医疗资源有限的国家进行检测。最后，对于开发诊断测试的公司来说，每一次试剂盒的迭代都需要重新努力获得CE-IVD认证，这可能会阻碍开发新的测试或试剂盒的改进。六、总 结所有不可手术治疗的NSCLC患者都需要尽快筛查生物标志物（5~10天内出结果），以选择一线靶向治疗、免疫治疗或免疫治疗+化疗组合。在欧洲，分子检测和靶向治疗的各国临床指南总体上依照ESMO/NCCN指南，并根据各国的医疗模式和资源相适应。EGFR、ALK和PD-L1的分子检测在欧洲已得到普遍应用，部分国家还对ROS1、BRAF和NTRK进行检测。目前，KRAS、MEK、MET、ERBB2/HER2、RET、FGFR1/2/3 和NRG1 的检测仅在学术机构或临床试验机构开展并限用于研究用途。各国在提供分子检测方案和相应的靶向疗法方面的差异，部分反映了国家或地区一级的报销状况和/或保险覆盖率。为了提高遗传学指导下肺癌治疗的应用，ESMO指南推荐使用MTB模式，由临床医生、分子病理学家、分子生物学家、遗传学家和生物信息学家共同参与治疗团队。在医疗机构结构允许的情况下，对晚期NSCLC患者进行反馈实验是可取的，可以最大程度地缩短组织学诊断到启动一线靶向治疗之间的时间间隔。NGS技术的改进增强了一次检测中对一组驱动基因突变的分析；然而即使在最佳运行设置下，NGS的运行时间仍然相对较长（1~2周）。目前，可以将NGS与单基因突变检测的快速筛查方法共同应用以避免时间较长的问题。因此NGS仍需要进一步改进，以缩短运行时间，避免重复检测。液体和组织活检的NGS检测被认为可以互相补充，液体活检的结果报告更快，而组织活检的假阴性率更低。此外，组织活检和液体活检的联合使用可以允许对再次活检进行综合的验证，以提供NSCLC疾病进展过程中纵向肿瘤进化和异质性改变的角度见解。这一检测思路可以识别可靶向治疗的生物标志物，并指导后续二线治疗方案；还支持发现新的生物标志物和治疗药物；然而，随着检测复杂性的增加，确保分子检测报告的结果被临床医生充分解读也是十分重要的。译自： LungCancer154(2021)161–175
（责任编辑：dawenwu）