HCV从发现到被清除：检验视角下HCV检测与应用史

作者：杨瑞锋副研究员单位：北京大学人民医院，北京大学肝病研究所1. 本年度诺贝尔生理学或医学奖三位获奖者中，跟检验诊断领域关系最密切的是哪一位？2. HCV发现获得了诺贝尔奖，SRAS-CoV-2的发现者也会吗？3. 为什么HCV根治性药物DAA的研发者没有获奖？4. 相比20年前，现今的HCV感染实验室检测，是简单了还是复杂了？ 2020年诺贝尔生理学或医学奖颁给了从事丙型肝炎病毒（HCV）研究的三位科学家——Harvey J. Alter、Michael Houghton及Charles M. Rice。得益于他们的研究成果，HCV这种曾严重威胁人类健康的病原体，从发现到即将被根除，仅用了几十年时光。三位科学家的成果按照时间顺序排列，从输血领域注意到这种新病原体的存在，到分子生物学技术确定病原体，再到体外复制模型助力根治性治疗药物——直接抗病毒药物（DAA）的诞生，构成一条非常完整的科研逻辑链（图1）。可以这样理解，HCV作为“沉默的杀手”的同时，也充当了人类科技进步的一面镜子，是分子生物学研究飞速进步并给人类带来福祉的一个缩影。病毒千千万，为什么诺贝尔奖颁给了HCV研究？继澳大利亚抗原（俗称“澳抗”，即乙型肝炎病毒表面抗原，HBsAg）研究获得1976年诺贝尔生理学或医学奖之后，HCV是第二个被诺奖青睐的肝炎病毒。检验君分析HCV获奖的原因如下。01HCV是人类历史上第一个依赖分子生物学技术鉴定的病原体虽然HCV在嗜肝病毒的五位兄弟中排行老三，但它却最难、最晚被发现，这是因为，人类血清和肝脏中的HCV颗粒并不像其他兄弟病毒那样含量丰富，病毒难以富集和通过形态学进行鉴定。HCV是第一次单纯通过分子生物学技术被鉴定的病毒（图2），也开启了分子生物学诊断传染病的新时代。02HCV的鉴定，是在诺贝尔奖技术（噬菌体展示技术）基础上的诺贝尔奖成果HCV发现依赖的核心技术是当时刚刚新起的“噬菌体展示技术”，该技术在1985年被发明（并已在2018年被授予诺贝尔化学奖）。噬菌体是一种以细菌为宿主的病毒，将外源基因序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，外源基因跟随外壳蛋白的表达而表达，并且被展示到噬菌体表面。该技术使得蛋白的高通量筛选变成可能，促进了治疗药物（如治疗自身免疫性疾病的明星药物——阿达木单抗）及临床检验诊断技术的发展。Houghton等将源于被HCV感染猩猩血浆中的cDNA插入噬菌体λgt11，表达的蛋白展示于噬菌体表面，然后利用丙型肝炎患者血清中的抗体，对噬菌体文库进行筛选，最后发现了源于病毒的基因片段5-1-1（图3）。由此可见，HCV的发现是站在伟人肩膀上做出的伟大成就，体现科技的完美传承。不过，利用噬菌体展示技术捕捉HCV的路却是充满艰辛。当年以Houghton领导的Chiron公司科研工作者，历经7年时间，筛选了上百万株基因克隆，才幸运地发现了一段HCV基因，可见即使手握天才技术，也要付出极大的耐心、汗（金）水（钱），才能结出果实。03生物学新技术战斗力爆表的当下，仅凭发现新型病原体就获得诺贝尔奖会很难今年全球严重疫情中，鉴定SARS-CoVer-2基因组，对抗体和核酸试剂的研发和疫情防控同样起到了关键作用。不过，笔者认为，该病毒的发现和鉴定获得诺贝尔奖的可能性微乎其微。且不说SARS-CoV-2并非像HCV一样是“全新”病毒，主要原因是，疫情发生的当今，检测新型新病原体的技术已进化为“组学”（-omics），科学家可以利用新一代测序技术（NGS），撒大网，高通量检测，地毯式搜索，从而使得新型病原体越来越无处遁形。如果HCV身处今天，可能也像SARS-CoV-2一样，基因组在几天甚至更短时间内就能得到破解（图4），这种宏基因组NGS（mNGS）检验技术也是当今微生物诊断的风口，值得紧密关注；另一方面，当今生物技术战斗力爆表，极富有暴力美学，但终究显得简单粗暴，也使得上世纪常见的小型实验室单打独斗，依靠精巧思路和精巧的实验设计取胜的概率变得越来越小，未来的科学研究势必也会加速进入团队化、集约化、吸引资本巨头操纵的时代。04HCV体外复制子模型的建立，打开了HCV感染治愈之门HCV被发现后的七八年间，人们一直找不到一个细胞模型能被其感染，从而无法深入了解它的特点，并研发有效的直接抗病毒药物。Charles Rice通过比较HCV RNA序列，找到了共有的关键序列，成功解决了HCV无法感染活细胞的难题；他将HCV亚基因组序列注入到猩猩体内后，成功诱导了丙型肝炎；之后他又开发出全新细胞系，病毒可在其中高效复制。自此，科学界有了能用来筛选抗HCV药物的细胞模型，其后小分子抗HCV药物筛选飞速跃进，甚至没等科学家们完全阐明HCV的复制和致病机制，根治性药物——直接抗病毒药物（direct-actingantiviral agents，DAAs）已经问世，这也是人类历史上第一次实现依靠药物根治一种病毒的壮举。05科学理解丙型肝炎根治性药物的发明者为何与2020年诺贝尔奖无缘DAA是一系列小分子抗病毒药物的总称，其中最明星的分子无疑是索非布韦（Sofosbuvir，商品名Sovaldi），该药的命名与Michael J. Sofia先生紧密相连。作为一名优秀的药物化学家，Sofia在前人小分子化合物研发的基础进行分子改造，成功研发索非布韦并于2013年获得FDA批准上市。索非布韦是HCV RNA聚合酶NS5b的强效抑制剂，彻底改变了传统的干扰素联合利巴韦林治疗丙型肝炎的方案，将患者从肌肉注射干扰素的副作用、长疗程、低治愈率的苦痛中解放，同时，也成就了吉利德公司“麻雀变凤凰”的商业神话，之后推出的吉二代、吉三代、吉四代都是以索非布韦为骨架的DAA组合。如果把HCV的体外复制模型比作大树的枝干，那么，索非布韦就是最靓的果。但诺贝尔奖青睐的是开创性的发现或发明，这与基因编辑CRISPR技术的推动者张锋先生错过今年诺贝尔化学奖多少有些类似，意料之外，又情理之中。此外，索非布韦太过耀眼的商业奇迹，笔者认为，或多或少也遮盖了它背后的科学气质。诺贝尔奖成果对HCV检验诊断领域影响01基于噬菌体展示技术发现的HCVNS4抗原片段，构成初代抗体试剂的雏形1989年4月，Science连续刊出Michael Houghton的两篇论文，第一篇确认了HCV基因片段5-1-1的存在，它是非结构蛋白4（NS4）基因的一部分；另一个研究则在酵母中表达了更大分子量的NS4蛋白片段c100-3，基于放射免疫技术（RIA），在疑似丙型肝炎患者血清中检测到了对应抗体。与此同时，Houghton所在的Chiron公司联合奥森多（Ortho）公司，迅速推出了第一代酶联免疫吸附试验（ELISA）HCV抗体诊断试剂，在检验市场捷足先登。02HCV抗体试剂的进化史随着HCV全基因组序列及关键蛋白的破译，HCV的血清抗体谱变得明晰，这给HCV抗体试剂的持续优化奠定了基础。Chiron-Ortho依据包被不同抗原区段、构成比例作为分“代”（Generation）的主要标准，试剂被分为第一、二和三代。第一代HCV抗体试剂所用的抗原来自NS4区的c100片段，它的使用使HCV输血感染率下降了80%以上，但其灵敏度和特异性均有不足；Chiron-Ortho随后相继推出第二和三代试剂，以及全球首款第三代化学发光法（CLIA）试剂，保持了在诊断市场的领先地位。第二代试剂加入了HCV核心区多肽c22和非结构区抗原c33，缩短了窗口期，提高了检测灵敏度；第三代试剂中，核心区抗原比例下降,c33比例提升，同时增加了NS5抗原，灵敏度和特异性进一步提升（下图）。雅培（Abbott）公司也较早介入HCV诊断领域，获得了Chiron-Ortho包被抗原HCr43和c100-3的生产许可，同样占据了诊断市场相当大的份额。了解这段历史的话，我们就容易理解，为何Ortho Vitros和雅培Architect试剂的HCV抗体滴度正相关，因为两者“师出同门”；对于“低值阳性”抗体结果，应尽量避免使用带有“亲缘”关系的品牌试剂复测，有同时产生“假阳性”结果的可能性。这种“代”的划分标准，也可理解为Chiron-Ortho试剂版本（Version）的升级，对其他多数试剂而言，并无普适性。事实上，除了抗原区段及其比例要优化之外，其他试剂生产工艺，包括抗原的来源（原核/真核表达或人工合成多肽）、蛋白修饰、蛋白纯化、及显色技术等因素，都会影响诊断性能；CLIA灵敏度较高，易实现自动化，已成为当今HCV抗体检验的主流技术。03HCV抗体检测的“通病”——无法回避的“假阳性”结果流行病学数据的准确性受制于检验试剂的性能。我们可以回顾一段历史——根据1992年全国传染病流调结果，我国普通人群HCV感染人群高达3.2%。当时检测抗体所用的试剂，存在高“假阳性”率；且研究者未对抗体阳性结果复测，或进一步进行确认试验，从而导致流行率数据畸高；十四年之后的第二次全国流行病学调查则采用更为成熟的HCV抗体试剂，且对阳性标本其他品牌试剂重测，大幅减少了“假阳性”结果，最终阳性率为0.43%，比早前的数据降低了87%，显然这一数据更接近真实世界的HCV抗体流行率。当前，市场上都是经过不断优化的HCV抗体试剂，“假阳性”结果发生率大大降低，但问题依旧存在，给被检者徒增精神压力和不必要的随访。不过，从统计学角度也不难理解，传染病筛查指标着重强调灵敏度，势必会牺牲特异性，导致假阳性结果的产生。几种国内外试剂“低值阳性”区间见下表。“高值阳性”结果有95%的可能性为真阳性，而“低值阳性”结果的真阳性概率不大，建议使用其他品牌试剂复测，而现在的趋势是，具备核酸检测的地区，不再区分抗体阳性结果是“高值”还是“低值”阳性，直接加测HCV RNA，以明确有无丙型肝炎和是否治疗。注：ELISA，酶联免疫吸附试验；CLIA，化学发光技术；*试剂可能有升级，数值仅供参考。数据来源：http://www.cdc.gov/hepatitis/HCV/LabTesting.htm；ChinJ Hepatol. 2005,13:255；中华检验医学杂志,2016,39:90-94.04诺贝尔成果促生强效、泛基因型DAA诞生，极大简化了HCV的检测在以前干扰素联合利巴韦林治疗丙型肝炎的时代，清除HCV需要一年甚至更长时间，病毒载量下降缓慢，因此，需要在抗病毒治疗中频繁监测RNA以指导治疗。而当今我们身处强效、泛基因型DAA时代，大部分患者服药几天后，病毒载量就急速降低甚至消失，3个月疗程结束后，治愈率能达到95%~99%，因此，对HCV RNA监测的频率和对HCV RNA试剂灵敏度的要求都大大降低，见下图。同样，在干扰素联合利巴韦林治疗丙型肝炎的时代，需要检测HCV基因型，不同基因型的疗效和疗程都有不同；而随着“吉三代”Epclusa为代表的泛基因型DAA药物的推广，基因型检测也变得无足轻重。05仰望诺奖，立足现实——认清当今HCV领域主要的矛盾受益于诺贝尔奖的成就，HCV感染的诊断技术日趋成熟，治疗也变得越来越简单。不过，在我们迈向“消除病毒性肝炎作为重大公共安全威胁”的理想境界的同时，仍有很多感染者在承受因没有得到及时诊断而罹患肝硬化和肝癌的沉重代价，因此，主动出击，发现、治疗潜伏的HCV感染，提高我国HCV感染者的诊断率，仍然是一项长期、重要的工作。重点筛查对象包括感染高危人群（输过血及血液制品的人、血液透析者、接受脏器移植者、母亲是丙型肝炎的婴幼儿、有过牙科手术、肌肉或静脉注射、针灸、耳朵打孔、纹身美容等的人，静脉吸毒者等）、高流行地区人群，以及低流行区特定出生队列人群等，抗体检测简便、快捷，仍然是HCV感染筛查的首选方法，但今年SARS-CoV-2疫情导致核酸检测布局加速，病原微生物核酸检测条件成熟的地区，也可考虑直接筛查HCV RNA。参考文献：[1] Alter HJ， Holland PV， Purcell RH， Lander JJ， Feinstone SM， Morrow AG， Schmidt PJ. 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