原标题：Gastroenterology（IF 33.883）| 单细胞转录组+空间转录组+多色免疫荧光揭示
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种极具侵袭性、预后极差的恶性疾病，其特点是微环境复杂。从肿瘤形成的最早阶段开始，致癌驱动因子就促进肿瘤微环境 (TME) 中免疫细胞和基质细胞成分的积累，从而创造一个免疫抑制生态位，塑造支持肿瘤进展的微环境状态。另外，尽管免疫治疗对多种实体恶性肿瘤有效，但 PDAC 对免疫治疗具有很强的耐药性，因此迫切需要对 PDAC 的免疫微环境有一个更为细致的了解。
5月26日，德国海德堡大学医院和德国癌症研究中心在内的多家科研院所，联合在胃肠疾病领域最著名的期刊 Gastroenterology （IF 33.883） 上发表了名为 “Spatially resolved multi-omics single-cell analyses inform mechanisms of immune-dysfunction in pancreatic cancer”的文章，该研究收集了 PDAC 患者的组织和血液样本，通过 单细胞测序、空间转录组学、多重荧光免疫组化技术 联合分析，从空间维度上全面的揭示了 PDAC 中多层次的免疫功能紊乱，并提出了 PDAC 免疫景观的整体观点，为 PDAC 的治疗提供了可靠的信息。
研究结果
1.人胰腺导管腺癌免疫微环境单细胞图谱
作者首先收集到9例胰腺癌患者的肿瘤组织和邻近非肿瘤胰腺组织，分选出CD45-CD45+细胞进行单细胞转录组测序（10x Genomics scRNA-seq），同时使用CyTOF和 FACS分析了从肿瘤切片中获得的白细胞组分和从每个患者术前采集的血液样本中获得的PBMC。另一边，作者也同时使用了多重荧光免疫组化技术（AKOYA mfIHC）和空间转录组测序（10x Visium）对未受干扰TME中的原位免疫反应进行匹配分析（图1A）。通过scRNA-seq鉴定的主要免疫亚群在与之对应的FFPE组织切片区域中使用mfIHC进行了验证和定量，发现CD4 T细胞、调节性T细胞（Tregs）和巨噬细胞的显著富集于肿瘤组织中。接着作者进一步分析了TME内所有主要细胞类型的细胞邻域及其与肿瘤的接近程度（图1D-F），结果显示肿瘤-免疫细胞的相互作用在空间上受到限制，只有成纤维细胞和树突细胞积聚在肿瘤边界。
图1.人胰腺导管腺癌免疫微环境单细胞图谱
2.胰腺导管癌肿瘤微环境中CD8T和NKT细胞功能失调
在无偏聚类得到的CD8 T细胞亚群中，作者鉴定出一组CD8组织驻留记忆（CD8-Trm）表型和3个CD8 T效应细胞（CD8-Teff）群体，发现CD8-Teff细胞存在于PDAC TME内，但它们的细胞毒性潜力可能受损。为了更好地了解PDAC TME中CD8 T细胞群的进化，作者通过轨迹分析发现PDAC中的CD8 T细胞逐渐衰竭和功能障碍的表型。接着利用mfIHC验证了PDAC TME中表达各种抑制性受体的衰竭CD8 T细胞的存在（图2E）。在进一步分析CD8 T细胞的空间分布之后，发现PRF1 CD8 T细胞几乎不存在于PDAC TME内，并且倾向于在肿瘤边界和CD163巨噬细胞附近轻微富集（图2F-I）。然后，作者通过CyTOF分析了肿瘤和相应血液样本中的CD8 T细胞亚群，发现CD8 T淋巴细胞功能障碍主要存在于肿瘤部位。
接下来，作者基于scRNAseq数据，在相邻的正常和PDAC组织中鉴定了NKT细胞（图1B）。mfIHC证实了CD3 CD56细胞在两个位点的存在（图3A）。与 CD8 Teff 细胞相似，NKT 细胞具有较高的细胞毒性潜力，不过在TME中，NKT细胞功能上仍不成熟。随后，作者发现外周NKT细胞表现出更强大的细胞毒性表型，但在肿瘤浸润的NKT细胞中几乎完全减弱（图3E）。此外，肿瘤浸润性NKT细胞表现出异常耗竭的表型（图3F），NKT细胞倾向于在肿瘤边界富集（图3H和I）。与来自结直肠癌（CRC）、癌症和肺腺癌（LUAD）的NKT细胞相比，PDAC中效应分子的表达尤其受损（图3K）。
图2 胰腺导管癌肿瘤微环境中CD8 T细胞功能失调
图3 胰腺导管癌肿瘤微环境中NK T细胞功能失调
3.肿瘤浸润性CD4 T细胞在癌症中具有异常的功能障碍表型，TME中B淋巴细胞表现出调节性免疫抑制表型
为了探究CD4 T细胞潜在的功能状态，作者从PDAC和邻近正常组织中收集CD4 T细胞来对其基因表达谱进行全面分析。鉴定出了与幼稚CD4 T细胞，活化CD4 T淋巴细胞，记忆性CD4 T细胞（CD4-Tmem）一致的图谱的簇（图4A和B）。作者观察到CD4 T细胞耗竭的两种不同模式（图4A–C）。在肿瘤部位，CD4CD52细胞被证明可引导Treg和巨噬细胞进入TME。此外，轨迹分析表明，幼稚的CD4 T细胞在PDAC中大多进展为Treg和CD4CD52亚型（图4D），CD4-Tex簇几乎完全来源于肿瘤样本（图4E和F）。Tregs与CD4-Tact-IFNG细胞和CD4-Tmem细胞一起在肿瘤部位积聚，CD4CD52细胞在邻近的非肿瘤区域内相对更丰富（图4E和F）。mfIHC分析证实TME中存在耗尽的CD4 T和Treg表型（图4G），并且以TIGIT表达为标志的CD4 T细胞在肿瘤块附近和肿瘤块内显示出更高的丰度，揭示了CD4 T淋巴细胞介导的免疫抑制在PDAC TME中被放大。
之后，作者为了进一步评估PDAC中B细胞的功能状态，使用MS4A1/CD20高表达B细胞进行重新聚类，获得了3个不同的亚群，包括幼稚B细胞、类别转换记忆B细胞和表达与浆母细胞一致的谱的细胞。作者发现肿瘤浸润的幼稚和记忆B细胞表达升高水平的TGFB1，B细胞似乎分散在整个PDAC TME中，但在肿瘤上皮细胞附近减少（图1E）。基于成像的细胞邻近度分析表明，与其他细胞类型相比，B细胞和T细胞以及巨噬细胞之间的物理距离略短（图1F）。类似地，基于scRNAseq数据的细胞-细胞通讯分析显示，与TME中的其他细胞类型相比，表达TGFB1的B细胞倾向于与CD8 T细胞和巨噬细胞更紧密地相互作用。
图4 肿瘤浸润性CD4 T细胞在癌症中具有异常的功能障碍表型
4.胰腺导管腺癌肿瘤微环境中的髓细胞主要偏向肿瘤促进亚群，肿瘤浸润树突细胞具有交叉呈递能力受损的功能障碍表型
作者对巨噬细胞和单核细胞群体进行了进一步的亚聚类，获得的4个亚簇都可以在肿瘤和邻近的正常组织中鉴定，其中CD14+单核细胞在TME中相对更丰富，而C1Q巨噬细胞在邻近正常组织中富集（图5C）。mfIHC验证了肿瘤和邻近正常区域中存在2个表型不同的巨噬细胞亚群（图5D）。值得注意的是，与MARCO巨噬细胞相比，在巨噬细胞中，C1Q亚群表达了更高水平的参与抗原呈递和共刺激的基因，相比之下，MARCO巨噬细胞的特征是维持肿瘤促进微环境的基因表达更高（图5E），并通过基因集富集分析得到证实（图5F）。与巨噬细胞类似，主要的PDAC浸润的CD14+单核细胞群体表达高水平的参与血管生成和免疫调节的基因，表明它们具有促肿瘤作用，而不太丰富的非经典CD16+单核细胞表现出促炎表型（图5B和G）。
作者随后在TME中发现了一组活化的树突细胞（DC），共表达与DC成熟和免疫调节相关的基因，类似于其他实体癌中富含免疫调节分子的成熟DC，可能减弱T细胞活化和细胞毒性（图6B）。此外，作者鉴定了一簇高表达的促炎细胞因子的DC，以及一群浆细胞样DC（图6A和B）。mfIHC分析证实了PDAC TME中的主要DC亚群（图6D）。值得注意的是，在PDAC中cDC1亚群表达的参与抗原交叉呈递的基因水平很低，揭示了其可能与促进Treg迁移和血管生成有关。
图5 胰腺导管腺癌肿瘤微环境中的髓细胞主要偏向肿瘤促进亚群
图6 肿瘤浸润树突细胞具有交叉呈递能力受损的功能障碍表型
5.胰腺导管腺癌免疫微环境的空间组成及其与局部上皮转录状态的相关性
为了进一步研究PDAC中免疫细胞亚型的空间分布及其与恶性上皮细胞的关系，作者利用组织切片进行了空间转录组测序。在所有患者中，与周围基质相比，肿瘤区域中幼稚的CD8、CD8-Trm、cDC1、cDC2、单核细胞衍生的DC、NK细胞和C1Q巨噬细胞以及肥大细胞显著减少（图7D）。此外，作者观察到单核细胞、C1Q巨噬细胞和CD4CD52 T细胞的浸润在基底样区域和经典区域之间显著不同，4个C1Q巨噬细胞在基底样恶性细胞附近富集。类似地，CD4CD52 T细胞在基底样区域附近大量存在，但被排除在经典肿瘤部位之外，这与基底样肿瘤观察到的更具侵袭性的表型一致。接着，为了进一步表征PDAC中的细胞-细胞相互作用，作者分析了TME中参与免疫反应的配体-受体对，结果揭示了T和NK细胞活性以及免疫逃避的抑制环境（图7E和F）。
图7 胰腺导管腺癌免疫微环境的空间组成及其与局部上皮转录状态的相关性
6.胰腺导管腺癌患者免疫微环境的组成及其与预后的关系
为了系统地绘制肿瘤浸润性免疫亚型的组成差异及其对患者生存的影响，作者使用mfIHC在30名PDAC患者的组织样本中量化了免疫浸润。作者发现，在短期生存队列中，B细胞（CD20+）、NKT细胞（CD3+CD56+）、NK细胞（CD56+）和选择性活化巨噬细胞（CD68+CD163+）的比例显著更高。相反，CD4 T、CD8 T和单核细胞来源的DC（CD11C+BDCA1+CD1A+）在长期存活者中显示出显著更高的丰度。接着，作者使用了之前发布的数据集进行分析，结果显示，较高的B、NKT、IL-4+NKT和交替激活的巨噬细胞特征与较短的总生存期显著相关，而较高水平的CD3 T（不包括Tregs和NKT细胞）、CD4 T、CD8 T，和CD8-Teff-GNLY细胞与更长的生存期相关，与mfIHC得到结果一致。
结论
在本次PDAC研究中，通过单细胞与空间多组学技术的结合，更清晰地展示了肿瘤内和肿瘤间异质性，以及免疫-肿瘤细胞相互作用大多局限于衰竭的免疫抑制表型的研究结果。除了功能失调的APC外，表达抗原呈递机制的癌相关成纤维细胞可能诱导T细胞无能，抑制抗肿瘤免疫反应并支持肿瘤生长。这些结果揭示了胰腺癌症的多层免疫功能障碍，同时也评估了免疫亚群在PDAC发展和进展中的潜在因果作用，为未来功能上的研究和PDAC的治疗铺平了道路。
参考文献：
1. Yousuf S, Qiu M, Voithenberg LVV, et al. Spatially resolved multi-omics single-cell analyses inform mechanisms of immune-dysfunction in pancreatic cancer. Gastroenterology. 2023;S0016-5085(23)00810-7. doi:10.1053/j.gastro.2023.05.036.
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